蜂胶抗炎功效成分研究

袁雯雯 常化松 玄红专

（聊城大学生命科学学院，聊城 252059）

蜂胶是西方蜜蜂采集植物树脂并混入上颚腺、蜡腺等分泌物经加工而成的一种胶状物质。蜂胶是一种天然药物，具备丰富而独特的生物活性，如抗细菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤、抗真菌、免疫调节、保护心血管[1-6]等。目前从蜂胶中鉴定出的化学组分高达20多类、 600多种，主要有黄酮类、酚酸类、萜烯酸、类固醇类、氨基酸类[7-9]等。中国蜂胶是一种重要的蜂胶类型，主要植物来源为杨属植物，由于其广泛的生物学活性，目前已广泛应用于食品、保健品和药品等行业，但其功效成分和作用机理还未完全阐明。

我们前期通过半制备型高效液相色谱结合大孔吸附树脂粗分离的方法，从蜂胶水提物中分离纯化出11种化学成分（咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素）[10,11]；此外，通过不同浓度（40%～90%）的甲醇-水洗脱，从蜂胶脂溶性提取物中分离纯化出8段物质（Ⅰ-Ⅷ）[12]。我们前期实验表明，蜂胶的抗肿瘤功效成分是黄酮类物质及其酯类[11]。蜂胶的抗炎功效成分是否与其抗肿瘤功效成分相同，目前还不清楚。本实验基于前期分离制备的蜂胶水提物中分离的11种组分和蜂胶乙酸乙酯提取物中分离的8段成分，通过2种不同的炎症模型，研究了蜂胶抗炎的功效成分，为蜂胶的抗炎活性应用提供基础实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人脐静脉血管内皮细胞（聊城大学生命科学学院细胞实验室保存）。

中国蜂胶产自山东省，胶源植物主要为杨属植物；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰酶、磺酰罗丹明B（SRB）（sigma）；细胞培养皿、96孔板；Tris（上海生工）；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

HFsafe1200超净工作台、MCO-17A CO2培养箱（上海力康科学仪器有限公司）；TE2000S倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）；AR2140电子分析天平（美国奥豪斯公司）；优普超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 蜂胶水溶部位主要组分的分离、纯化

蜂胶水溶部位11种组分的分离、纯化，具体步骤见[10]，采用大孔吸附树脂粗分离结合半制备型高效液相色谱法对蜂胶水溶部位的主要组分进行分离、纯化，操作步骤如下：（1） 中国蜂胶水提物的制备；（2）醇沉；（3） 大孔吸附树脂粗分离；（4） 半制备型高效液相色谱分离纯化；（5） 纯度检测及结构鉴定。得到11种化合物分别是：咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素。

1.3.2 蜂胶脂溶性部位主要成分的制备、分离、纯化、鉴定

蜂胶水提物的残渣经乙酸乙酯浸提，然后经40%～90%不同浓度的甲醇-水洗脱，得到8段组分（Ⅰ-Ⅷ），具体步骤见[12]。其中，分离到的8段组分，通过HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析检测，主要成分如下表1。

1.3.3 细胞的培养

HUVEC细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中。孵育条件为：5% CO2、37℃、饱和湿度CO2培养箱中。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.3.4 细胞存活率的测定

表1 蜂胶乙酸乙酯提取物中分离到8段组分的主要化学成分

将处于对数生长期的HUVEC按2000个/孔种植到96孔板，37℃，5% CO2孵育，待细胞长到60%以上，经 100ng/ml LPS 和 40μg/ml ox-LDL 诱导细胞损伤，分别经不同浓度的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸（5，10，20μM）、短叶松素、白杨素、松属素、高良姜素、芹菜素、咖啡酸苄酯、CAPE（0.2，1和 5μM）处理 HUVEC 6，12和 24h，分别经不同浓度（1.25，2.5μg/ml）的Ⅰ-Ⅷ 8段提取物处理HUVEC细胞12h，弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，然后用SRB染色10min，晾干，100 mM Tris碱溶解，在492nm处测吸光值。

图1 4种酚酸对LPS诱导的HUVECs细胞存活率的影响

图2 5种黄酮类化合物对LPS诱导的HUVECs细胞存活率的影响

图3 2种酯类对LPS诱导的HUVECs细胞存活率的影响

细胞存活率（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%

1.4 数据统计

采用SPSS v11.5软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±S）表示，采用t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异显著。

2 实验结果

2.1 中国蜂胶水提物中11种化学成分对LPS诱导的HUVEC细胞存活率的影响

2.1.1 4种酚酸对LPS诱导的HUVECs损伤的作用

我们首先检测了4种酚酸（5，10，20μM）在0.5%血清条件下经LPS（100ng/ml）刺激后对HUVECs细胞存活率的影响。如图1所示，HUVECs在0.5%血清条件下经LPS（100ng/ml）刺激后存活率显著下降，经不同浓度的咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸（5，10，20μM）处理12和24h后对细胞存活率有一定的促进作用。咖啡酸和阿魏酸较异阿魏酸和3,4-二甲氧基肉桂酸效果更显著（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.1.2 5种黄酮类化合物对LPS诱导的HUVECs损伤的作用

我们接着检测了5种黄酮类化合物即短叶松素、松属素、白杨素、芹菜素、高良姜素（0.2，1和5μM）对LPS刺激的HUVECs细胞存活率的影响，结果如图2所示，短叶松素、松属素、白杨素在0.2μM时促进细胞的存活。芹菜素、高良姜素对LPS处理的HUVEC的存活率的影响不明显（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.1.3 2种酯类化合物对LPS诱导的HUVECs损伤的作用

最后我们检测了2种酯类即咖啡酸苄酯、CAPE（0.2，1和5μM）对LPS刺激的HUVECs细胞存活率的影响，结果如图3所示，在6h时，咖啡酸苄酯在5μM的浓度下对LPS处理的HUVECs存活率有促进作用，CAPE在12h时显著促进HUVECs存活率（*P＜0.05，**P＜0.01）。

图4 11种组分对ox-LDL诱导的HUVEC细胞存活率的影响

图5 不同浓度的8段组分对LPS诱导的HUVEC细胞存活率的影响

2.2 蜂胶水提物中11种组分对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的作用

此外，我们利用ox-LDL诱导内皮细胞损伤，检测了11种化合物对内皮细胞存活率的影响。由图4可以看出，11种组分对ox-LDL刺激的HUVECs细胞存活率的影响不同，其中阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、咖啡酸苄酯、松属素和高良姜素在一定浓度范围内可以促进ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.3 乙酸乙酯提取物中8段组分对LPS诱导的HUVECs细胞存活率的影响

我们从乙酸乙酯浸提物中通过不同浓度的甲醇-水洗脱得到了8段组分，并通过LPS刺激内皮细胞检测了8段组分对内皮细胞损伤的影响，结果见图5。由图5可以看出，1.25μg/ml和2.5μg/ml的8段组分能够保护LPS造成的内皮细胞损伤，提高内皮细胞的存活率（*P＜0.05，**P＜0.01）。

3 讨论

蜂胶的化学成分十分复杂，目前蜂胶应用中最大的难题就是药效不稳定，药效物质基础不明确，本实验通过2种不同的炎症细胞模型对蜂胶水提物中11种组分以及乙酸乙酯提取物中的8段组分对炎症细胞的功效分别进行了检测。研究发现，蜂胶水提物中11种组分及乙酸乙酯提取物的8段不同组分对2种不同的炎症细胞均有不同程度的促进细胞存活率的功效。由此可见蜂胶发挥抗炎功效的成分比较复杂，很可能是多种成分的协同功效，而且酚酸类物质在蜂胶抗炎功效中也发挥了重要作用。在蜂胶抗肿瘤功效成分研究中，发现蜂胶抗肿瘤的功效成分主要是黄酮类化合物及其酯类物质，酚酸类物质抗肿瘤功效很弱。由此我们可以推断出，蜂胶在发挥不同生物学功效时其功效成分并不完全相同。我们需要对蜂胶发挥不同生物学活性的功效成分进行深入研究，以期为蜂胶的质量标准提供实验依据，为人类更好的利用蜂胶提供理论依据。