LC-MS/MS法快速筛查辣椒制品中8种禁用苏丹染料

李贞，陈科

（1.内蒙古商贸职业学院，内蒙古呼和浩特010070；2.广东省食品检验所，广东广州510663）

苏丹染料是一类化工染色剂，主要用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也用于油、腊、鞋油和地板等的增光。但苏丹染料并非食品添加剂，因具有偶氮结构而决定其具有致突变性和致癌性，对肝肾器官具有毒性作用，已被国际癌症研究机构列为三级致癌物[1-3]。欧盟、日本、中国均不容许食品中添加苏丹染料，但由于用苏丹染色后的食品颜色非常鲜艳且不易褪色，易引起人们食欲，一些不法企业把苏丹染料添加到食品中。为此，有必要建立高灵敏、准确、快速的筛查苏丹染料的检测方法。

目前关于苏丹染料的检测方法主要有液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4-10]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）[11]和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12-16]，但HPLC法和LC-MS法对于辣椒制品（辣椒粉、辣椒油、辣椒酱等）复杂基质样品中苏丹染料测定缺少二级质谱确证，准确性和灵敏度较差，而LC-MS/MS法具有准确度和灵敏度高、选择性强等优点，但采用LC-MS/MS法快速筛查辣椒制品中苏丹染料的报道较少[4，9，11]。本文选择 8 种苏丹染料（苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹蓝Ⅱ、苏丹黄）作为分析对象，辣椒制品经正己烷萃取，氧化铝柱净化，建立了辣椒制品中8种禁用苏丹染料的LC-MS/MS快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8030型液相色谱-串联质谱仪、UW6200H电子分析天平：日本岛津公司；KQ-250B超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司；BYDCY-12Y型氮吹仪：上海秉越电子仪器有限公司。

苏丹染料标准品：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹蓝Ⅱ、苏丹黄，纯度均≥98%：购自中国计量科学研究院；正己烷、石油醚、环己烷、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙腈、甲醇、乙酸铵（均为色谱纯）：购自德国Merck公司；其余试剂均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司；试验用水为超纯水。辣椒制品（辣椒粉、辣椒油、辣椒酱等）：当地超市和农贸市场。

苏丹染料标准储备液：准确称取适量的苏丹染料标准品，用乙腈溶液配制成浓度为1 000 μg/mL的标准储备液，4℃以下保存，有效期6个月。

苏丹染料标准工作液：用乙腈将苏丹染料标准储备液逐级稀释至浓度为 2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的混合标准工作溶液，临用时配制。

1.2 LC-MS/MS条件

液相色谱条件：色谱柱为XR-ODS（4.6mm×100mm，2.2 μm）；流动相A为乙腈；流动相B为0.1%甲酸水溶液；流速为0.5 mL/min；柱温为30℃；进样体积为10 μL；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution process of the mobile phase

质谱条件：ESI+电离模式；多反应监测模式（MRM）；加热模块温度为400℃；脱溶（desolvation，DL）管温度为250℃；干燥气为氩气，流速为15 L/h；碰撞气压力为230 kPa。

1.3 样品前处理

准确称取样品5 g（精度至0.1 mg）于50 mL离心管中，加入25 mL正己烷，涡旋混匀，超声萃取10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液；残渣再加入10 mL正己烷，重复提取1次，合并上清液，加入5 g无水硫酸钠脱水，45℃氮吹浓缩至3 mL，经中性氧化铝SPE柱净化，10 mL正己烷淋洗，5 mL含5%丙酮的正己烷溶液洗脱，氮气吹干后用乙腈溶解定容至1 mL，供LC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

分别对1.0 mg/mL苏丹染料标准品进行一级ESI+、ESI-电离模式分析，结果显示8种苏丹染料在ESI+模式下响应较好，且均形成[M+H]+离子。在ESI+电离模式下进行二级质谱分析，并优化质谱条件，选取响应强度相对最高的离子对作为定量离子对，选择响应强度相对最稳定的离子对作为定性离子对，8种苏丹染料的相关质谱参数见表2。

2.2 色谱柱的选择

分析了ZORBAX SB-C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、XR-ODS（4.6 mm×100 mm，2.2 μm）、CORTECSTM C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）不同型号规格色谱柱对8种苏丹染料的色谱分离效果。结果表明，采用ZORBAX SB-C18和CORTECSTM C18色谱柱，部分苏丹染料色谱峰拖尾严重，而采用ZORBAX Eclipse Plus C18和XR-ODS色谱柱，苏丹染料色谱峰峰型基本良好，尤其是采用XR-ODS色谱柱，8种苏丹染料色谱峰峰型对称、尖锐（图 1），故选择 XR-ODS（4.6 mm×100 mm，2.2 μm）作为色谱分析柱。

表2 8种苏丹染料质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of 8 kinds of Sudan dyes

2.3 流动相的选择

分析了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、10 mmol/L乙酸铵-甲醇、10 mmol/L乙酸铵-乙腈等不同流动相对苏丹染料的色谱分离效果。结果表明：0.1%甲酸加入流动相可有效促进苏丹染料形成[M+H]+峰，提高其质谱响应，当采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，各目标物色谱响应较高，且经流动相梯度洗脱后，8种苏丹染料可有效分离（见图1）。故选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。

图1 8种苏丹染料的总离子流色谱图（50.0 ng/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of 8 kinds of Sudan dyes（50.0 ng/mL）

2.4 萃取溶剂的选择

分析了正己烷、环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等不同极性溶剂对苏丹染料的萃取率影响（见图2）。结果表明：按照8种苏丹染料平均萃取率高低顺序依次为：正己烷（96.1%）＞环己烷（91.2%）＞二氯甲烷（87.6%）＞乙酸乙酯（82.9%）＞氯仿（73.6%），其中正己烷对8种苏丹染料的萃取率在91.6%～101.3%之间，平均萃取率为96.1%，故选择正己烷作为萃取溶剂。

2.5 固相萃取柱的选择

图2 不同提取试剂对8种苏丹类色素提取效率的影响Fig.2 Effect of different reagents on extraction efficiencies of 8 kinds of Sudan dyes

分析了 C18、C8、CN、NH2、Florisil、Alumina-N、Alumina-A、Alumina-B、MCX、SCX、WCX 等不同填料的固相萃取柱对苏丹染料的净化回收率影响。结果表明：采用Alumina-N固相萃取柱时，8种苏丹染料的平均净化回收率最高达95.3%，这可能是由于Alumina-N固相萃取柱的表面处理呈中性，通过与铝金属中心相互作用，与表面硅醇基团形成氢键或点电荷的表面进行离子交换吸附8种苏丹染料，且对其保留能力较强，从而具有较高的净化回收率，故选择Alumina-N作为固相萃取柱。

2.6 基质干扰的影响

为避免辣椒制品基质对苏丹染料检测的干扰，在纯乙腈和空白辣椒制品中采用标准加入法，按照公式基质效应ME/%=|（B/A-1）|×100（式中：A为纯乙腈中目标物的质谱响应强度；B为空白辣椒制品中目标物的质谱响应强度）评价LC-MS/MS法测定辣椒制品中苏丹染料的基质效应，其中当B＞A时，为基质增强效应；当B＜A时，为基质减弱效应。当ME＜10%时，表现为不存在基质干扰现象；当20%＞ME＞10%时，表现为低程度基质干扰现象；当50%＞ME＞20%时，表明为中程度基质干扰；当ME＞50%时，表明为高程度基质干扰。结果显示：在纯乙腈和空白辣椒制品两种不同基质中分别加入100.0、500.0、2.5 ng/mL 3种浓度的8种苏丹染料标准物质，经本文所建LC-MS/MS法测定辣椒制品中苏丹染料的基质效应ME值在3.4%～8.7%之间（见表3），这表明不存在明显的基质干扰效应。

2.7 线性范围、方法检出限和测定下限

将空白辣椒制品基质中依次加入质量浓度为2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL 的 8 种苏丹染料混合标准液，按本文所建LC-MS/MS法测定，以质谱响应强度（y）为纵坐标，以苏丹染料的质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线（见表4）。从表4中可知：8种苏丹染料在2.5 ng/mL～500.0 ng/mL质量浓度范围内，呈现良好的线性关系，相关系数r2≥0.999 5。

表3 苏丹染料在纯乙腈和空白辣椒制品中的基质效应Table 3 Matrix effect of Sudan dyes in pure acetonitrile and white pepper products

用空白辣椒制品基质溶液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度为方法检出限（method detection limit，MDL），并以4倍检出限作为测定下限（见表4）。从表4中可知：8种苏丹染料的检出限为0.62 ng/mL～6.25 ng/mL，测定下限为 2.5 ng/mL～25.0 ng/mL。

表4 线性范围、方法检出限、测定下限、平均回收率和精密度Table 4 Linear range，method detection limit，lower limit of measurement，average recovery and precision

2.8 回收率和精密度

取空白基质辣椒制品，分别添加3个浓度水平，按本文所建LC-MS/MS法测定加标回收率和精密度，每个浓度水平重复测定6次（见表4）。从表4中可知：8种苏丹染料的平均回收率在92.4%～98.6%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在 1.7%～3.8%之间，均符合方法学的要求。

2.9 实际样品的测定

按本文所建LC-MS/MS法对20份实际辣椒制品（8份辣椒粉、6份辣椒油、6份辣椒酱）进行8种禁用苏丹染料种类和含量的快速筛查。结果表明：20份受检辣椒制品中，1份辣椒酱检出含有禁用苏丹红G（含量为325.6 ng/mL），其余19份辣椒制品中未检出苏丹染料，这表明市场上所销的辣椒制品中可能存在非法添加禁用苏丹染料现象，食品行政监管部门应对其加强日常监督检验。

2.10 与现有检测方法的比较

本文所建LC-MS/MS法与文献报道的检测方法相比较（见表5），所用仪器较精密、分析对象的基质成分较复杂、同时检测的苏丹染料种类较多、回收率高、检出限低、精密度好，回收率和RSD均符合国家认监委要求采用认证认可行业标准RB/T 208-2016《化学实验室内部质量控制比对试验》的要求。

表5 不同检测方法的比较Table 5 Comparison of different analysis methods

3 结论

本研究以苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹蓝Ⅱ、苏丹黄等为研究对象，采用正己烷萃取辣椒制品，经氧化铝柱净化，建立了辣椒制品中8种禁用苏丹染料的法LC-MS/MS法快速筛查方法。结果表明：8种苏丹染料在2.5 ng/mL～500.0 ng/mL质量浓度范围内，呈现良好的线性关系，相关系数 r2≥0.999 5；检出限为 0.62 ng/mL～6.25 ng/mL，测定下限为2.5 ng/mL～25.0 ng/mL；平均回收率在92.4%～98.6%之间，RSD在1.7%～3.8%之间。该LCMS/MS法适用于快速筛查复杂基质辣椒制品中8种禁用苏丹染料，且具有回收率高、检出限低、精密度好等优点。