黔野生猕猴桃果酱的制备及体外抗氧化性研究

2019-01-21

食品研究与开发 2019年3期

（遵义医学院公共卫生学院人畜共患病研究所，贵州遵义563003）

黔产野生猕猴桃属猕猴桃科（Actinidia arguta Sieb.Zucc.），猕猴桃属（Actinidia），是多年生落叶藤本植物。世界上约有猕猴桃属植物66种，主要分布于亚洲的东部和南部。我国有猕猴桃62种以上，其中西南和东部地区种类较多，贵州复杂的地貌和独特的气候环境造就了黔产野生猕猴桃适宜的生长环境，据统计，每年可采收的黔产野生猕猴桃量为10 000吨[1-3]。长久以来，受限于交通、运输等地理因素以及该类水果本身的特质（黔产野生猕猴桃属于呼吸跃变型果实，采后易腐烂且成熟的果实不便贮运，市场货架期短），黔产野生猕猴桃这一宝贵的资源没有得到充分利用，在某种程度上形成了资源的浪费。目前，对于猕猴桃的加工利用现在主要有果汁、果脯、果酱、果酒、果醋[4]及一些新开发的产品如果冻、猕猴桃冰激凌、食用猕猴桃籽保健油[5]等。在欧美地区，果酱是消费者喜爱的食品。市场调查表明，随着现代生活节奏的加快，近些年来国人的饮食习惯有欧美化的倾向，如，简单便捷的“面包+果酱”成为人们早餐搭配的首选[6]。有研究证实，黔产野生猕猴桃具有营养功能和保健功能，其富含维生素C和多种矿物质，此外还含有黄酮类、多糖类等功能活性成分，有降血糖、血脂、减肥、抑制衰老的功效，是开发功能保健食品的优选原料[7-8]。然而其制备成果酱后，是否还具有抗氧化功能，至今未有报道。前期的市场调研表明，目前市面上还没有黔产野生猕猴桃果酱。基于此，本研究拟以黔产野生猕猴桃为原料，开发一款黔产野生猕猴桃果酱，并对果酱在体外的抗氧化功能进行初步的研究，这将有利于黔产野生猕猴桃这一宝贵资源的开发及利用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

野生猕猴桃：产自贵州省；黄原胶、果胶、海藻酸钠、柠檬酸（食品级）：郑州安安康食品化工有限公司；白砂糖（食品级）：广西东南亚扶南精糖有限公司；无水乙醇（AR）：重庆川东化工有限公司；抗坏血酸（AR）：北京索莱宝科技有限公司；DPPH（AR）：合肥博美生物科技有限责任公司。

FA2004N分析天平：上海菁海仪器有限公司；HPB2000电子天平：福州华志科学仪器有限公司；JP-100S超声波清洗机：深圳市设备有限公司；759S紫外可见分光光度计：上海箐华科技仪器有限公司；1000/200/20μL移液枪：大龙兴创实验仪器有限公司；H1650-W台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；P70D20P-N9微波炉：广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；JYL-C50T榨汁机：杭州九阳电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

参照杨茜然等[9-10]果酱制作工艺流程并进行了修改，生产工艺流程：原料的挑选→热烫→清洗→去皮→护色→打浆→调配→搅拌→微波加热→搅拌→加热杀菌→成品。

1.2.2 操作步骤说明

原料的挑选及打浆：挑选饱满、颜色均匀、表面完整的七八分成熟的野生猕猴桃，放入微波热烫60 s、冷却后清洗、去皮、切块等预处理后，将野生猕猴桃放入0.6%柠檬酸溶液进行护色2 h，按比例称取一定量猕猴桃与水加入打浆机（猕猴桃与水的质量比为2∶1）。

调配：将增稠剂（果胶、黄原胶、海藻酸钠）按比例与白砂糖充分的搅拌均匀，倒入果浆混合均匀，转入盛装的玻璃瓶中。

浓缩：将调配好的野生猕猴桃果浆的玻璃瓶放入微波中中火浓缩3 min，取出加入柠檬酸搅拌均匀，再次放入微波中火浓缩杀菌1 min，取出封盖即为成品。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 白砂糖添加量单因素试验

取打浆好的一定量的野生猕猴桃果浆，根据预试验添加果胶0.6%+海藻酸钠0.6%，柠檬酸添加量0.5%，充分搅拌均匀以后进行微波加热。设计了30%、40%、50%、60%和70%的添加白砂糖量的试验，通过感官评分差异来确定果酱工艺中最适宜的白砂糖用量。

1.2.3.2 柠檬酸添加量的单因素试验

取已经确定好的白砂糖的最佳添加量，加入果胶0.6%+海藻酸钠0.6%，与果浆充分搅拌均匀以后进行微波加热灭菌。设计0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的柠檬酸的量进行试验，通过感官评分差异来确定黔产野生猕猴桃果酱工艺中最适宜的柠檬酸用量。

1.2.3.3 增稠剂添加量的单因素试验

取已经确定好的白砂糖及柠檬酸的最佳添加量，设计了果胶1.2%、黄原胶1.2%、海藻酸钠1.2%、果胶0.6%+黄原胶0.6%、海藻酸钠0.6%+果胶0.6%、黄原胶0.6%+海藻酸钠0.6%，通过感官评分差异来确定黔产野生猕猴桃果酱工艺中最适宜的增稠剂用量。

1.2.4 正交试验设计

本试验采用影响果酱品质的3个主要因素，设计白砂糖添加量、柠檬酸添加量和增稠剂添加量进行试验，采用正交表进行试验方案设计，如表1所示。

表1 黔产野生猕猴桃果酱正交试验因素水平设计Table 1 Horizontal design of orthogonal experiment of wild kiwifruit jam

根据果酱的相关标准[11]对于果酱的感官要求有色泽、滋味与口感、组织状态、杂质4个指标。本研究采用加权评分法并采用德菲尔法进行赋分权打分，经统计获得由4个评价因素构成的权重集，如表2所示。

表2 黔产野生猕猴桃果酱权重打分表Table 2 Weight scores for wild kiwifruit jam

说明：依据色泽、滋味与口感、组织状态、杂质评价因素对于果酱的总体评价结果影响的重要程度，进行的重要性比较打分，感官评价者根据相对重要性打分，很重要—很不重要，打分4～0；较重要—不很重要，打分3～1；同样重要，打分2～2。本试验的方法是把人的感觉作为测量仪器，评定黔产野生猕猴桃果酱的色泽、滋味与口感、组织状态、杂质等感官特性，对正交的试验进行感官分析，以此得出黔产野生猕猴桃果酱的最佳配比。黔产野生猕猴桃果酱感官评分标准见表3。

表3 黔产野生猕猴桃果酱感官评分标准Table 3 Criteria for sensory evaluation of wild kiwifruit jam

1.2.5 体外抗氧化试验设计

1.2.5.1 清除DPPH自由基法

1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）是一种稳定的有机自由基。通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱[12-14]。参考Larrauri[15]和Yokozawa等[16]的方法进行修改，本是验采用清除自由基（DPPH·）法评价黔产野生猕猴桃果酱的抗氧化活性。

1.2.5.2 黔产野生猕猴桃果酱的前处理

精确称取野生猕猴桃果酱4.992 53 g将其溶于水中，定容到100 mL配制成50 mg/mL，放入超声提取器中700 W、温度40℃、提取60 min，避光静置将大悬浮物沉淀到底，取上清液稀释成 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL溶液，然后进行抗氧化活性的测定。

DPPH溶液的配制：精确称取0.002 14 g DPPH溶于无水乙醇，定容到100 mL配制成0.05 mmol/mL的溶液。避光反应10 min在2 h之内测定完成，避免DPPH挥发影响试验结果。

将果酱的上清液配制成不同浓度的溶液，分别用移液器量取2 mL反应液加入2 mL DPPH反应30 min，用紫外分光光度计测量吸光值Ai，取2 mL去离子水加入2 mL无水乙醇放入比色皿中进行仪器的调零，取2 mL去离子加入2 mL DPPH溶液放入比色皿中作为空白对照。使用紫外分光光度计在吸收峰517 nm测量吸光值Ao，分别取果酱溶液2 mL加入2 mL无水乙醇溶液，在吸收峰517 nm测量吸光值Aio。

1.2.5.3 标准曲线的绘制

抗坏血酸做阳性对照，进行平行试验，去离子水与DPPH反应作为阴性对照，使用分析天平精确称取抗坏血酸标准品0.010 12 g，加入去离子水中定容到100 mL配制成0.1 mg/mL的抗坏血酸溶液，将其稀释成 0.002 5、0.005、0.007 5、0.01、0.012 5、0.015、0.017 5、0.02、0.022 5、0.025 mg/mL 的溶液。

DPPH溶液的配制：精确称取0.015 92 g溶于无水乙醇中定容到100 mL配制成0.5 mmol/mL的溶液，避光反应10 min在2 h之内测定完成，避免DPPH挥发影响试验结果。

分别取抗坏血酸标准溶液2 mL反应液加入2 mL DPPH反应30 min。用紫外分光光度计在吸收峰517 nm测量吸光值Ai，用2 mL去离子加入2 mL无水乙醇放入比色皿中进行仪器的调零，用2 mL去离子加入2 mL DPPH溶液放入比色皿中作为空白对照。使用紫外分光光度计测量吸光值Ao，分别取2 mL抗坏血酸溶液加入2 mL无水乙醇溶液，在吸收峰517 nm测量吸光值Aio，将抗坏血酸对DPPH自由基的清除率与抗坏血酸的浓度做标准曲线。

1.2.5.4 计算公式

清除率计算公式：清除率/%=[Ao-（Ai－Aio）/Ao× 100

式中：Ao为2 mL去离子水+2 mL DPPH反应测得吸光值；Aio为2 mL抗坏血酸溶液或者果酱提取溶液+2 mL无水乙醇溶液；Ai为2 mL抗坏血酸溶液或者果酱提取溶液+2 mL DPPH反应测得吸光值。

实际清除率/%=[（清除率×反应加入的DPPH量）/样品质量（μg）]

求得单位质量的抗坏血酸或黔产野生猕猴桃果酱样品DPPH自由基的实际清除率，根据线性回归方程计算半数抑制浓度IC50（DPPH吸收降低50%时抗氧化剂的量）。

2 结果及分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 白砂糖添加量对野生猕猴桃果酱风味的影响

黔产野生猕猴桃的酸度偏大，白砂糖应适量添加，以免添加过多造成甜腻，白砂糖的添加量少造成果酱过酸、过涩，白砂糖的适量添加能使果酱形成高渗透压抑制微生物的生长，增加野生猕猴桃果酱的保质期。本研究设计了5个添加白砂糖水平的试验（30%、40%、50%、60%和70%），1%～20%的白砂糖添加量会促进部分微生物的生长，野生猕猴桃果酱有酸味和涩味，野生猕猴桃果酱酱体太稀，只能增加增稠剂的量来改善品质。当白砂糖的添加量为70%因糖浓度过高果酱太甜、口感欠佳，甜度过高使人产生腻的口感，其中30%、40%和50%水平甜酸比比较适宜，果酱的酱体比较均匀、涂抹性好、具有野生猕猴桃的绿色。因此挑选出白砂糖添加量为30%、40%和50%作为正交试验的3个水平。

2.1.2 柠檬酸添加量对野生猕猴桃果酱风味的影响

目前采用的调节食品酸味剂主要是柠檬酸，柠檬酸是一种有机酸，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸的酸味不腻，入口即酸味而来，后味延续时间短。试验设计了5个水平的柠檬酸添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%）。柠檬酸添加量为0.2%酸度太小会使野生猕猴桃果酱较甜，影响果酱的口感，柠檬酸的添加量为0.6%野生猕猴桃果酱太酸。其中0.3%、0.4%和0.5%猕猴桃果酱的酸度适中、具有猕猴桃果香。因此挑选出0.3%、0.4%、0.5%柠檬酸添加量作为正交试验的3个水平。

2.1.3 增稠剂种类和添加量对野生猕猴桃果酱风味的影响

增稠剂的种类和添加量对黔产野生猕猴桃果酱的影响很大，果胶一般是从柑橘皮、苹果皮、其他果皮等植物细胞的提取物。黄原胶是黄单胞多糖，是一种由假黄单胞菌属发酵产生的单孢多糖。海藻酸钠是一种天然多糖。通过试验得出单独添加果胶、黄原胶和海藻酸钠试验的果酱不太好、不均匀、不易涂抹、明显分层、有水析出、有结晶，明显影响果酱的感官。果胶0.6%+黄原胶0.6%、海藻酸钠0.6%+果胶0.6%和海藻酸钠0.6%+黄原胶0.6%得到的野生猕猴桃果酱均匀、易涂抹、不分层、无水析出、无结晶、黏稠度比较好，因此挑选果胶0.6%+黄原胶0.6%、海藻酸钠0.6%+果胶0.6%和海藻酸钠0.6%+黄原胶0.6%作为正交试验的3个水平。

2.2 正交试验结果分析

2.2.1 权重系数

权重系数的计算：将各评委对于色泽、滋味与口感、组织状态和杂质4个指标权重评分进行统计计算得到表4，将各指标的权重因素总分除以全部因素总分之和得权重系数：Ⅹ=[0.250，0.288，0.242，0.221]

表4 黔产野生猕猴桃混合果酱的权重打分统计表Table 4 Weight score statistics table for wild kiwifruit mixed jam

2.2.2 黔产野生猕猴桃果酱正交试验结果分析

本试验进行L9（33）正交试验，将正交试验得到的黔产野生猕猴桃果酱进行随机的编号，邀请30名有经验的人士按照表3进行感官评价，在常温下将30 g黔产野生猕猴桃果酱夹于淡化饼干中用小杯子呈递给感官人员。然后收集感官评价表结合表4的权重系数进行试验结果分析，每一位感官人员对果酱的色泽、滋味与口感、组织状态和杂质的评分计算加权后的评分，求得感官人员对于果酱的最终评分，最后计算各个感官人员对于每一种正交试验工艺配比所得的感官评分的平均分，计算统计得到表5。

表5 正交试验结果表Table 5 Orthogonal test results

续表5 正交试验结果表Continue table 5 Orthogonal test results

根据极差的大小，判断对黔产野生猕猴桃果酱制作后的感官的影响程度的大小。极差（R值）越大，表示该因素的水平变化对本试验的影响越大，因此在本试验中这个因素就越重要；反之，极差（R值）越小，则说明因素的水平变化对试验的影响越小，因此在本试验中这个因素越不重要。从试验结果可以得出增稠剂种类（C）极差最大，则说明增稠剂种类变化对黔产野生猕猴桃果酱影响的主要因素，其次是白砂糖添加量（A），影响最小的因素是柠檬酸的添加量（B）。黔产野生猕猴桃果酱的最佳的工艺配比为A3B3C3（该条件下感官最高评分为80.06），即白砂糖添加量50%，柠檬酸添加量为0.5%，增稠剂添加量为黄原胶0.6%+海藻酸钠0.6%即为本试验得到最佳的黔产野生猕猴桃果酱。

2.3 黔产野生猕猴桃果酱体外抗氧化试验结果分析

2.3.1 抗坏血酸与清除DPPH自由基的关系

本试验采用抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力作为黔产野生猕猴桃果酱对DPPH自由基的清除能力的阳性对照，根据1.2.4.2步骤得到的吸光值按照1.2.4.4计算清除率的公式，计算得到不同浓度的抗坏血酸的DPPH自由基清除率，使用excel软件做出散点图，然后添加趋势线得到线性方程和R2值，即得到不同浓度抗坏血酸与DPPH自由基的清除率的标准曲线（图1）。

从图1可以看出抗坏血酸浓度与DPPH自由基清除率有比较好的的线性关系（R2=0.998 3），线性回归方程为y=3 505.1x-3.350 3，抗坏血酸溶液的浓度与清除DPPH自由基能力呈显著线性相关关系。根据线性回归方程计算得出IC50=0.015 mg/mL。

图1 抗坏血酸溶液浓度与DPPH自由基清除率的关系Fig.1 The relation of the concentration of ascorbic acid and the ratio of scavenging DPPH·

2.3.2 黔产野生猕猴桃果酱与清除DPPH自由基的关系

按照1.2.4.2步骤得到果酱与DPPH反应后的吸光值，按照1.2.4.4计算清除率的公式，计算得到不同浓度的黔产野生猕猴桃果酱的DPPH自由基清除率，使用excel软件做出散点图，然后添加趋势线得到线性方程和R2值，即得到不同黔产野生猕猴桃果酱与DPPH自由基的清除率的曲线（图2）。

图2 黔产野生猕猴桃果酱与DPPH自由基的清除率的关系Fig.2 The relation of the concentration of wild kiwifruit jam and theratio of scavenging DPPH·

从结果可以看出黔产野生果酱提取浓度与DPPH清除率有比较好的的线性关系（R2=0.993），线性回归方程为y=4.159 3x+4.604 1，黔产野生果酱溶液的浓度与清除DPPH自由基能力呈显著线性相关关系。根据线性回归方程计算得出IC50=10.898 mg/mL。黔产野生猕猴桃果酱对稳定的有机自由基DPPH自由基有清除作用。

3 讨论

黔产野生猕猴桃营养丰富，维生素C含量远高于人工培育的猕猴桃[17]，但按照传统的果酱制备工艺，在加工过程中伴随着美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸降解、多酚氧化酶等酶被激活或钝化等化学反应，最终将引起果酱色泽改变及抗氧化活性成分的改变[18]。为了保留猕猴桃中抗氧化活性的成分并保持其原有的色泽不被改变，焦凌霞等[19]采用微波热烫的方法对猕猴桃进行前处理，赵光远等[20]用柠檬酸溶液进行护色处理，张丽华等[21]的研究同样表明，相比传统的加热方式，采用微波对猕猴桃果酱进行浓缩加热，耗时最短，抗坏血酸和绿色损失比较小。本研究在以黔产野生猕猴桃为原料制备果酱的过程中，采用微波加热的方式，并在此基础上予以优化即微波炉中火加热浓缩3 min，杀菌1 min。研究发现相对于传统的加热方法，该工艺下果酱的浓缩时间大大缩短，果酱的褐变得到有效改善，最终产品果香浓郁、口味纯正、酸甜适中、口感细腻、无明显颗粒、酱体均匀、易于涂抹、无明显分层、无水析出、无结晶、色泽自然、透亮、无杂质。由此可见，微波加热法在果酱制备工艺过程中值得推广。食品的各项感观指标在感官评价过程中因其对产品质量的贡献不同而占有不同的权重，考虑到影响果酱感官的各项指标，本研究最终采用加权评分法来降低感官评价过程中对评价结果造成的偏差。本研究采用L9（33）正交试验来确定黔产野生猕猴桃果酱的最佳加工工艺，结合感官分析结果，最终确定本研究中果酱的最佳工艺配比为白砂糖50%，柠檬酸0.5%，增稠剂黄原胶0.6%+海藻酸钠0.6%。正交试验分析结果表明增稠剂是影响果酱质量和口感的关键因素：增稠剂的添加量将对果酱的酱体、涂抹性、黏度等产生直接影响，同时也能对果酱的甜度与酸度之间的平衡起到一定的协调作用。

研究发现，猕猴桃果实具有抗氧化能力，且野生猕猴桃果实的抗氧化能力远高于人工种植的猕猴桃品种[22]。已有研究表明野生猕猴桃的抗氧化能力可能与其富含的维生素C、黄酮、多糖类等活性物质有关[23]。但做成果酱之后，野生猕猴桃是否还具有抗氧化能力，未见报道。本研究应用清除DPPH自由基的方法对黔产野生猕猴桃果酱进行体外抗氧化试验，经计算得出其果酱成品IC50为10.898 mg/mL，试验结果表明黔产野生猕猴桃在做成果酱后仍然具有抗氧化活性。