软枣猕猴桃雌雄株生长过程中植株形态及主要次生代谢产物变化

郑涵予， 李 越， 金香花， 赵 阳， 罗广军*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；2.敦化市大石头林业有限公司，吉林 敦化 133702；3.延边州森林调查规划院，吉林 延吉 133000)

软枣猕猴桃[Actinidiaarguta(Seib.et Zucc.)Plangch.ex Miq.]是猕猴桃科猕猴桃属中水平和垂直分布最广泛的多年生落叶藤本果树[1]。分布于中国南北各地，朝鲜、日本、俄罗斯亦有分布。以中国东3省的资源最为丰富，其中，小兴安岭和长白山地区较多见，是珍贵的抗寒果树资源。其果实富含维生素C、酚类物质、类胡萝卜素和多种矿质元素，并具有一定的药用价值[2]。软枣猕猴桃果汁、果酒、果酱等具有浓郁的软枣猕猴桃特有的风味，深受人们喜爱。目前，软枣猕猴桃作为第3代猕猴桃受到世界各国的广泛关注，其产业开发正在蓬勃发展。然而，由于软枣猕猴桃是雌雄异株植物，雌株经济价值明显要高于雄株，另外，软枣猕猴桃实生苗成熟需要5～7年，童期漫长，且实生繁殖后代出现4∶1(雄∶雌)的性别分离[3]，不利于生产需要。幼苗期雌雄无法辨别，给软枣猕猴桃种质资源的改良和育种带来巨大的困难。因此，软枣猕猴桃性别鉴定的研究在生产和遗传育种等方面都有重要的意义。

形态鉴定是植物区分雌雄的一种方法，可作为判定植物性别的一个重要性指标，具有直观、快速、简便的特点。关于雌雄异株植物性别鉴定的报道较多，早在50年代初波兰学者Bugala[4]就通过叶色确定欧洲山杨的性别。后来研究表明，银杏雌雄株幼苗期在植株、枝、叶、根等方面存在较大差异[5]；沙棘雌雄株在冬态、花期、生长期、植株形态、植株分布等方面存在较大差异[6]；徐东生等[7]应用多元统计分析中的判别分析方法判别猕猴桃(Actinidiachinensis)雌雄株，用能开花结果的成年树建立了判别方程，马丽媛等[8]对黄连木(pistaciachinensisBunge)雌雄叶子形态特征进行研究，显示雌雄株叶片叶柄长度及叶形指数具有显著性差异；谭冬梅等[9]发现阿月浑子(PistaciaveraL.)雌株与雄株在叶形指数方面具有极显著差异，吴委林[10]发现高山红景天(RhodiolaSaehalinensisA.Bor.)的叶长和叶宽具有极显著差异。勒振宁等[11]对杜仲(EucommiaulmoidesOliver)的外部形态、生长速度以及物候期等特征进行了研究，证明雌雄株间也存在较大差异。

次生代谢产物(Secondary metabolite)是由次生代谢(Secondary metabolism)产生的一类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物。次生代谢过程被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，它在处理植物与生态环境的关系中充当重要角色。雌雄异株植物次生代谢产物的差异研究亦有不少报道。王双明[12]发现银杏雄株的光和色素的总量高于雌株；李珊等[13]和郭晓亮[14]发现栝楼雄株幼苗叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、光和色素总量等均高于雌株，且达到显著差异水平。然而，软枣猕猴桃雌雄株间植物形态和次生代谢产物含量差异研究报道较少，也可能是因为取材时期不够全面尚未发现差异。植物在不同时期其代谢的途径和方式有所不同，仅从某一时期的形态和生理指标尚不能全面阐述雌雄株间差异，存在取材时期的偶然性。

为此，本课题组从2016年5—7月对软枣猕猴桃生长过程中的植株形态与主要次生代谢产物含量进行调查研究，从变化趋势和物质含量2个角度探索软枣猕猴桃雌雄株间的差异，进而为软枣猕猴桃性别鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以软枣猕猴桃雌雄株叶片和新稍为试验材料，选择树势中庸、无病虫害、5年生的野生软枣猕猴桃雌雄株各3株，于2016年5月4日—7月18日每隔15 d采收雌雄株叶片及新稍，放置低温采样箱后迅速带至实验室进行植株生长状况调查，然后把部分叶片样品洗净、液氮处理后，置-70 ℃超低温冰箱中保存，供色素、酚类物质、类黄酮等物质含量测定。

1.2 方法

软枣猕猴桃雌雄株物侯期参照张玉星等[15]人的描述进行观察记录；叶片纵径和横径以及叶柄长度利用游标卡尺测定；叶绿素a、b 及类胡萝卜素的含量测定采用Arnon[16]的方法；花青素相对含量的测定参照张志良等[17]人的方法，花青素的相对含量(色素单位)=(测得的OD值/0.01)/样品鲜样质量/g；总酚和类黄酮物质相对含量参照曹建康等[18]人的方法测定。

2 结果与分析

2.1 软枣猕猴桃雌雄株主要物侯期观察

课题组于2014—2016年对软枣猕猴桃雌雄株主要物侯期进行观察，结果如表1所示。软枣猕猴桃在延边地区的生育天数约为165 d，蕾期比较长，花期6月1日左右，开花持续10 d左右。雌雄株主要物侯期出现的时间整体上差异不大，基本一致。雄株萌芽稍早而展叶比较晚，这可能是雄株萌芽需要温度相对雌株较低，而展叶所需温度相对雌株较高。雌株始花期稍晚终花期亦稍晚，雌雄株花器官的差异决定了其具有不同的代谢途径。

表1 软枣猕猴桃雌雄株主要物侯期观察(延边地区)Table 1 Themain phenological period of male and female Actinidia arguta in Yanbian area

2.2 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中植株形态变化

2.2.1 叶片形态变化

软枣猕猴桃植株在整个生长发育时期内叶片不断变大，叶柄不断伸长。从叶形指数上看，软枣猕猴桃雌雄株叶形指数均大于1，叶片表现为长椭圆形。花期之前(6月3日)，雌雄株叶形指数均出现明显下降，叶片呈现出横向生长的趋势，而从花期开始，二者出现显著差异(P<0.05)，即雄株显著变宽而雌株变长(图1)。雌株花期叶片横径开始显著增长，这很有可能是开花需要积累更多的有机物，叶片光合作用是产生有机物的直接场所，宽大的叶片可以制造更多的有机物。雌雄株在整个生长过程中叶柄长度变化趋势基本一致，但雌株的叶柄长度显著大于雄株(P<0.05)。

图1 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中叶形指数及叶柄长度变化

2.2.2 新稍长度变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中新梢长度变化，如图2所示。软枣猕猴桃新梢增长快，当年生新梢年平均增长1 m以上。整个生长过程中雌雄株新

梢长度变化趋势一致，以坐果期(6月18日)为分界点，表现为前期快速增长，后期速度变缓。坐果期之后雄株新梢增长速度较雌株快，这很可能是雄株不结果所导致的差异。

图2 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中新稍长度变化

2.3 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中主要色素含量变化

2.3.1 叶绿素a含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中叶绿素a含量变化如图3所示。在整个生长过程中，雌雄株叶绿素a变化趋势和含量均存在差异。开花期之前雌雄株叶绿素a含量均缓慢上升，但雄株含量显著高于雌株。而花期之后，雄株表现为持续下降至最低值(1.22 mg/g)而后迅速升高至最高值(1.87 mg/g)，雌株则一直缓慢上升至最大值(2.01 mg/g)，此过程雌株叶绿素a显著高于雄株。这很可能是雌株坐果期到果实迅速膨大期需要积累更多的能量所致，而叶绿素a在此过程中主要参与光合作用。

图3 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中叶绿素a含量变化

2.3.2 叶绿素b含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中叶绿素b含量变化如图4所示。从含量上看，雄株的叶绿素b含量在蕾期到坐果期显著高于雌株，除此之外其他时期则相反。变化趋势上，雄株持续增长而后降低，而雌株出现降低-升高-降低的变化趋势。

图4 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中叶绿素b含量变化

2.3.3 类胡萝卜素含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中类胡萝卜素含量变化如图5所示。含量变化上，在坐果期出现雄株峰值和雌株谷值，此时雌株类胡萝卜素含量显著高于雄株，而其它时期则是雄株高于雌株。变化趋势上，雄株先降低后升高，而雌株则呈先升高后下降的趋势。趋势的差异主要出现在坐果期，此时期雌株依靠光合作用需要积累大量能量。类胡萝卜素含量在此时期出现的反差，可以说明在形成果实的过程中，类胡萝卜素可能起到重要作用。

图5 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中类胡萝卜素含量变化

2.3.4 花青素含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中花青素含量变化如图6所示。

图6 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中花青素含量变化

从含量上看，在整个生长过程中雄株的花青素相对含量均高于雌株(P<0.05)，坐果期之前表现显著差异，且开花期差异最大，此时雄株的花青素相对含量是雌株的2倍左右。从变化趋势上雌雄株间未见明显差异，均是先增高而后降低的变化趋势，只是雄株在花期出现了一个明显峰值。

2.4 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中总酚及类黄酮相对含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中总酚物质和类黄酮相对含量变化如图7所示。总酚物质和类黄酮相对含量变化趋势基本一致，整个生长过程中均表现出雄株含量大于雌株的现象，尤其在花期(6月3日)出现极显著差异(P<0.01)。雄株整体上呈先增加降低再增加的趋势，而雌株则是降低增加再降低的趋势。

图7 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中总酚和类黄酮相对含量变化

3 讨论与结论

3.1 软枣猕猴桃雌雄株主要物侯期观察

软枣猕猴桃雌雄株在生长过程中物侯期出现的时间整体上差异不大，基本一致。雄株萌芽稍早而展叶比较晚，雌株始花期稍晚终花期亦稍晚。萌芽、展叶以及开花是雌雄株进行花芽形态分化的时期，因此这3个时期很有可能是雌雄株出现差异的最佳时期。物候期是植物响应环境多年进化的结果，属于比较稳定的性状之一。软枣猕猴桃雌雄株响应环境因子时具有一定的性别响应差异[19]，雌雄株物候期差异尚不能作为直接鉴别性别的方法，但对于童期性别区分方法可以提供一定参考，处于童期状态的雌雄株物候期差异有待进一步讨论。

3.2 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中植株形态变化

软枣猕猴桃在整个生长发育时期内叶片不断变大，叶柄不断伸长。从叶形指数上来看，软枣猕猴桃雌株叶形指数均大于1，叶片表现为长椭圆形。花期之前，雌雄株叶形指数均出现明显下降，叶片表现出横向伸张的趋势，而从花期开始，二者出现显著差异(P<0.05)，即雄株显著变宽而雌株变长；在整个生长过程中叶柄长度变化趋势基本一致，但叶柄长度雌株显著大于雄株。叶柄长度与植株整个形态及受光程度密切相关，雌株结果需要积累更多的光能，叶炳长度的差异很有可能是软枣猕猴桃进化过程中适应环境的表现。

3.3 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中主要色素含量变化

雄株的花青素相对含量始终高于雌株，而叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素随着时期的不同而出现的差异不同，但多数在展叶期、花期及坐果期具有显著差异。软枣猕猴桃雌雄株光合作用存在差异，色素是影响光合作用的关键因子，由此可见，色素含量差别应该是造成软枣猕猴桃光合作用出现差异的主要原因。色素含量的差异是否适合童期还待进一步验证。

3.4 软枣猕猴桃雌雄株生长过程中总酚及类黄酮相对含量变化

软枣猕猴桃雌雄株生长过程中总酚物质和类黄酮相对含量变化趋势基本一致，整个生长过程中均表现出雄株含量大于雌株的现象。雄株整体上呈现先增加降低再增加的趋势，而雌株则是降低增加再降低的趋势。软枣猕猴桃雌雄株次生代谢产物存在差异[20]，生长过程中动态变化同样出现了差异，这表明软枣猕猴桃次生代谢途径存在差异，造成出现差异本质原因以及是否适用于童期有待进一步探究。