糯大麦与非糯大麦种子萌发和胚乳消亡的比较研究

邵珊珊，李发丽，余徐润，熊 飞

(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225000)

随着人们对大麦用途和营养价值认识的不断加深，大麦需求量逐年增加，应用发展前景十分广阔[1]。啤酒大麦的需求量也在逐年递增，中国目前已成为世界啤酒大麦第一进口国[2]。大麦颖果是生产大麦啤酒的原材料，胚乳是大麦颖果的重要组成部分，占粒重的90%以上[3]，主要贮藏物质为淀粉和蛋白质。Van Dongen等[4]和刘 美等[5]研究发现，胚乳中淀粉、蛋白质等储藏物质不仅为大麦种子萌发和幼苗早期生长提供了必要的能量供应，也是能量和营养物质的最主要来源。同时，大麦籽粒中的其他内含物如多糖、脂肪、灰分等也为大麦的萌发提供了物质基础[6-7]。有研究指出[8]，种子萌发是多种激素相互作用的结果；也有研究指出，淀粉酶和蛋白酶活性是决定大麦种子萌发速率的关键因素，胚乳中醇溶蛋白的聚合程度可以影响大麦的萌发速率[9]。胚乳细胞中的醇溶蛋白聚合体能包裹淀粉颗粒，种子萌发过程中淀粉酶与淀粉颗粒的接触、结合是淀粉颗粒降解所必须的，而未降解的醇溶蛋白聚合体的存在则阻碍淀粉降解酶的移动及其与淀粉的结合，进而限制淀粉水解[10]。目前，有关大麦萌发的研究较多[11-13]，但关于糯大麦与非糯大麦种子萌发和胚乳消亡的对比研究则较少。因此，本研究以典型糯大麦品种及非糯大麦品种为材料，采用组织化学染色、树脂半薄切片和光学显微镜观察等方法比较研究糯大麦与非糯大麦种子萌发过程中胚乳的消亡，以期为不同类型大麦在酿酒业及农业生产中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

糯大麦：白青稞(C2-2)和甘垦5号，由北京农科院提供；非糯大麦：扬农啤10号和苏裸麦1号，由扬州大学提供。大麦种子经1%次氯酸钠消毒30 min后，用清水洗净并晾干。暗环境下浸种12 h后置于含有2层纱布的培苗盘，25 ℃催芽。当大麦胚根长约为种子长的1/2时即视为发芽，开始光照培养。培养条件：光照25 ℃，16 h；黑暗18 ℃，8 h，定期等量补充水分。

1.2 种子组织化学染色

将不同萌发天数的大麦种子纵切，室温下用I2/KI(0.3%I2+1%KI)染色10 s，置于体视显微镜下观察颖果剖面着色情况。I2/KI染液可将含有淀粉的部位染成蓝黑色或红褐色，通过观察剖面着色情况判断淀粉的消耗情况。

1.3 胚乳淀粉体显微结构观察

取不同萌发天数的大麦种子，用刀片将需观察部位切成厚2 mm的薄片，放入2.5%戊二醛前固定液，4 ℃固定4 h，再经1%锇酸后固定、磷酸缓冲液(pH 7.2)清洗、乙醇系列脱水、环氧丙烷置换、低黏性Spurr树脂浸透和包埋，于70 ℃聚合成树脂样品块。采用超薄切片机制作成厚1 μm 的薄片，经0.5%甲基紫和1%番红染液复染色后于光学显微镜下观察并拍照。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0软件分析处理数据；采用LSD法进行显著性检验，数据以“平均值±标准误”表示；采用Adobe Photoshop CC 2017软件进行拼图比较。

2 结果与分析

2.1 大麦种子萌发情况

由表1可知，萌发3 d时，苏裸麦1号的总根长显著高于其他3个大麦品种，且扬农啤10号的总根长最短；萌发4 d时，不同品种的发芽势存在显著差异，其中白青稞的发芽势最高，为99.0%，扬农啤10号最低，为86.8%；萌发5 d时，苏裸麦1号的芽长显著高于其他品种大麦，且4个品种大麦间总根长存在显著性差异；萌发7 d时，甘垦5号的芽长显著低于其他品种，且4个品种间的总根长和发芽率均存在显著差异。由此发现，随着萌发天数的增加，糯大麦和非糯大麦种子萌发情况趋于稳定，总体上表现为糯大麦种子的发芽势和发芽率高于非糯大麦，说明糯大麦种子的发芽情况优于非糯大麦。

2.2 大麦种子萌发过程中胚乳的消耗过程

由图1可知，随着萌发天数的增加，胚乳逐渐吸水膨胀并伴随物质降解，结实的固体状物质变成松软的乳状物质，最后胚乳内物质完全消失。萌发2 d时，靠近盾片的胚乳开始消耗；且近胚端的胚乳变为胶状物质，此时，远胚端的胚乳尚未被消耗；萌发7 d时，绝大部分胚乳变成胶状物质并被消耗掉，I2/KI溶液染色不明显。由此可见，糯大麦和非糯大麦胚乳的消亡均是由近胚端开始，沿腹沟向远胚端延伸，且在种子萌发过程中，糯大麦胚乳的消亡速度明显快于非糯大麦。

表1 大麦种子萌发过程中的芽长、根长、发芽势和发芽率Table 1 Shoot length,root length,germination vigor and germination rate during the germination of barley seeds

同行数据后小写字母不同表示品种间在0.05水平差异显著。

Different letters within the same columns indicate significant differences at 0.05 level.

AL:糊粉层；Em:胚；En:胚乳；Sc:盾片；图中左侧数字为大麦萌发天数。

AL:Aleurone layer；Em:Embryo；En:Endosperm；Sc:Scutellum；The numbers on the left of the figure show days of barley germination.

图1大麦种子胚乳的消亡(I2-KI染色法)

Fig.1Extinctionofendospermduringgerminationofbarleyseeds(I2-KIstaining)

2.3 大麦种子萌发过程中胚乳淀粉体形态及数量的变化

2.3.1 近糊粉层胚乳中淀粉体的变化

大麦萌发早期，胚乳细胞中淀粉体排列紧密且充实紧凑。随着萌发天数的增加，胚乳细胞中淀粉体间隙变大，排列疏松，大、小淀粉体的数量均发生变化(图2)。萌发3 d时，近糊粉层胚乳中的淀粉体最先消亡，在糊粉层与内胚乳细胞间出现缝隙，糯大麦近糊粉层胚乳中淀粉体(图2G和图2J)的消亡早于非糯大麦(图2A和图2D)。萌发5 d时，靠近糊粉层的胚乳细胞已解体，胚乳细胞中的淀粉体大量降解，糊粉层与胚乳细胞间存在明显的缝隙，且糯大麦(图2H和图2K)的缝隙明显大于非糯大麦(图2B和图2E)。萌发7 d时，近糊粉层胚乳细胞中的淀粉体出现更大程度的降解，糯大麦剩余淀粉体数量少于非糯大麦，即糯大麦胚乳淀粉体(图2I和图2L)消亡速度快于非糯大麦(图2C和图2F)。

AL：糊粉层；En:胚乳；Pe:果皮；图上方数字表示大麦萌发天数。下同。

AL：Aleurone layer；En:Endosperm；Pe:Pericarp；The numbers on the top of the figure show days of barley germination.The same below.

图2大麦种子萌发过程中近糊粉层淀粉体的消亡

Fig.2Extinctionofstarchgranulesnearbyaleuronelayerduringgerminationofbarleyseeds

2.3.2 内胚乳中淀粉体的变化

萌发3 d时，糯大麦胚乳细胞中大淀粉体表面开始出现明显缺痕(图3G和图3J)，而非糯大麦胚乳淀粉体较为完整(图3A图3D)。萌发5 d时，糯大麦糊粉层与胚乳细胞(图3H和图3K)间的缝隙明显大于非糯大麦(图3B和图3E)，胚乳淀粉体也大量降解。萌发7 d时，糯大麦胚乳中含有少量正在解体的大淀粉体，小淀粉体几乎被消耗(图3I和图3L)，而非糯大麦胚乳中还含有较多的淀粉体残留(图3C和图3F)。

综合分析发现，在大麦萌发过程中，近糊粉层淀粉体消亡时间早于内胚乳，同一部位小淀粉体消亡时间早于大淀粉体，且在淀粉体表面先出现许多小坑，而后整粒淀粉被消化殆尽；糯大麦胚乳淀粉体的消亡较早，消亡速度也快于非糯大麦。

3 讨 论

种子萌发受环境因素、内部因素及萌发相关基因的共同调控[14-15]。其中，环境因素涉及水分、温度和光照等[14]；内部因素包括种子大小、种皮特征和种子休眠等[16]。本研究发现，相同生长环境下糯大麦种子的萌发较好，发芽率也较高，表明糯大麦和非糯大麦种子的内部因素及与萌发相关基因的表达存在一定差异。在种子萌发过程中，随着籽粒内贮藏物质的水解和消化，胚乳内含物逐渐变成浆状，残留的淀粉体游离其中。淀粉在淀粉酶和各种转化酶的作用下发生转化，在完整的淀粉颗粒上出现一些缺痕和微孔，并随淀粉颗粒降解程度的加深逐渐深化或变大[17]。本研究也观察到了类似的结果。

本研究结果还表明，大麦种子萌发过程中胚乳的消耗表现出一定的时序性，这与Yu等[18]的研究结果类似。首先是近胚端和靠近盾片的区域开始消耗，随后是靠近糊粉层的背部区域，最后沿腹沟延伸至远胚端。这可能是因为萌发早期盾片需要分泌大量的酶蛋白来水解胚乳中的贮藏物质[19]，同时来自糊粉层中的糊精酶也有助于降解胚乳细胞壁和淀粉粒壁层[20]。另外，糊粉层产生的淀粉酶在降解胚乳中起主要作用[21]。本研究表明，在大麦萌发过程中，近糊粉层淀粉体消亡时间早于内胚乳，同一部位小淀粉体消亡时间早于大淀粉体，这与袁秋华[21]的研究结果一致。袁秋华[21]的研究还指出，蛋白体和小淀粉体均先于大淀粉体被消耗。Li等[22]通过酶解研究发现，小淀粉体在早期的水解速度快于大淀粉体，而后期水解速度则小于后者，这可能与2种淀粉体的表面积-体积比、蛋白质含量等有关。本研究还发现，糯大麦胚乳淀粉的消亡时间早于非糯大麦，且其降解速度也快于后者，这可能与前者的支链淀粉含量较高有关[23]。而对于产生这些结果的具体机制，还需进一步研究。