EpCAM在前列腺癌中的表达及其相关临床意义

张继君　张桂平　韩小璐　刘薇薇　陶丽丽

【摘要】 目的：研究上皮特異性黏附分子（EpCAM）在正常前列腺组织、前列腺癌组织和骨转移性前列腺癌组织中的表达情况，并探讨其表达水平与临床病理特征及预后的关系。方法：结合公共数据库中的前列腺癌资料，分析EpCAM的mRNA和蛋白质表达水平。收集2014-2018年深圳市南山区人民医院及北京大学深圳医院正常前列腺标本18例、原发性前列腺癌71例、骨转移性前列腺癌标本12例。采用免疫组化EnVision法检测EpCAM蛋白在不同组织内的表达，并分析EpCAM的表达水平与前列腺腺癌临床病理特征的关系。结果：TCGA数据库、Human Protein Atlas数据库的分析结果显示，正常前列腺组织中EpCAM的mRNA和蛋白质水平明显低于前列腺癌组织（P<0.05）;EpCAM在不同种族、年龄及Gleason评分组之间前列腺癌组织中表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;与正常前列腺组织相比，前列腺癌FLI1+亚型和IDH1突变亚型的EpCAM表达未明显增加（P>0.05）;前列腺癌组织内EpCAM的DNA启动子序列甲基化水平低于正常前列腺组织（P<0.05），但不同年龄组前列腺癌之间的甲基化水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫组化检测结果显示，前列腺癌组织中EpCAM蛋白表达水平高于正常前列腺组织（P<0.05），尤其在前列腺癌骨转移组织表达更高（P<0.05）;在不同pT分期及Gleason评分的前列腺癌中EpCAM的蛋白水平比较差异均有统计学意义（P<0.05），而脉管及神经束侵犯组与其未侵犯组EpCAM蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：前列腺癌中EpCAM的mRNA及蛋白水平均高于正常前列腺组织，EpCAM的表达水平与前列腺癌分子分型、临床T分期、Gleason评分和及骨转移均密切相关，EpCAM的表达上调可能参与了前列腺癌的发生、进展和骨转移等过程。

【关键词】 上皮特异性黏附分子 正常前列腺组织 前列腺癌 骨转移性前列腺癌

Expression and Clinical Significance of EpCAM in Prostate Carcinoma/ZHANG Jijun， ZHANG Guiping， HAN Xiaolu， LIU Weiwei， TAO Lili. //Medical Innovation of China， 2019， 16（28）： 00-006

[Abstract] Objective： To investigate the expression of epithelial-specific adhesion molecule （EpCAM） in normal prostate tissue， prostatic carcimoma tissue and bone metastatic prostatic carcinoma tissue， and the correlations between the expression of EpCAM and its associated clinical data. Method： Combined with prostatic carcinoma data from public databases， mRNA and protein expression levels of EpCAM were analyzed. EnVision method was used to detected the expression of EpCAM in comprehensive tissue studies including 18 normal prostate specimens， 71 primary prostatic carcimoma tissues and 12 metastatic lesions from 2014 to 2018 at the Department of Pathology of Shenzhen Nanshan Peoples Hospital and Peking University Shenzhen Hospital. Statistically analyze the correlation between EpCAM protein and the clinicopathological parameters. Result： The data from TCGA and Human Protein Atlas database showed that the mRNA and protein levels of EpCAM in normal prostate tissues were significantly lower than that in prostatic carcinoma tissues （P<0.05）. There was no significant difference in the expression of EpCAM in prostatic carcinoma among different races， ages and Gleason groups （P>0.05）. Compared with normal prostate tissue， EpCAM expression in FLI1+ and IDH1 mutant subtypes of prostatic carcinoma were not significantly increased （P>0.05）. EpCAM DNA promoter sequence methylation level in prostatic carcinoma tissue was lower than that in normal prostate tissue （P<0.05）， without significant difference between different age groups （P>0.05）. Immunohistochemistry showed that the expression level of EpCAM protein in prostatic arcinoma tissue was higher than that in normal prostate tissue （P<0.05）， especially higher in prostatic carcinoma bone metastatic tissue （P<0.05）. EpCAM protein expression had significantly difference in different pT stages and Gleason scores of prostatic carcinoma （P<0.05）， with no significant correlation with vascular invasion and nerve invasion（P>0.05）. Conclusion： The mRNA and protein levels of EpCAM in prostatic carcinoma were higher than those in normal prostate tissue.The expression of EpCAM is closely related to the molecular typing， clinical T stage， Gleason score and bone metastasis of prostatic carcinoma. The up-regulated expression of EpCAM may be involved in the occurrence， progression and bone metastasis of prostatic carcinoma.

[Key words] EpCAM Normal prostate tissue Prostate carcinoma Bone metastatic prostate cancer

First-authors address： Shenzhen Nanshan Peoples Hospital， Shenzhen 518000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.28.001

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。前列腺癌的发病率和死亡率在世界不同地区表现出显著差异，其中以西方国家最高[1]，在2017年全美男性癌症相关死亡病因中位居第二位[2]。我国前列腺癌发病率总体较低，但近年随着人口老龄化及生活条件的改善，发病率有明显增加的趋势[3]。上皮细胞黏附分子（epicell adhesion molecular， EpCAM），又称CD326，属于黏附分子家族，是一种跨膜糖蛋白，主要包括3个部分，胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构域[4]。EpCAM于1979年首次由Herlyn等[5]在结直肠癌中发现，曾经被认为是结直肠癌的主要肿瘤相关抗原。近年来的研究表明，在原代前列腺癌组织和淋巴结转移中发现过表达EpCAM[6]。目前尚未明确EpCAM在前列腺癌中表达异常的具体机制，以及EpCAM在前列腺癌中表达升高对前列腺癌的发生、进展及其骨转移的影响。本研究旨在讨论EpCAM在良性前列腺组织、原发性前列腺癌及骨转移性前列腺癌组织中的表达情况及其可能的机制，并对EpCAM与前列腺癌患者的临床相关资料进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2014-2018年深圳市第六人民医院及北京大学深圳医院良性前列腺组织电切标本18例，前列腺癌根治切除标本49例，前列腺癌穿刺标本22例及骨转移性前列腺癌例标本12例。所有病例均经过病理确诊，共101例标本，患者年龄52～89岁，平均68.8岁。组织学分型：71例根治及穿刺标本组织类型均为经典型前列腺癌，12例骨转移性病例中1例组织学类型为前列腺癌伴神经内分泌分化，其余11例为经典型前列腺癌。前列腺癌根治标本49例中T分期：pT2a-c组8例，pT3-4组41例;8例见脉管内癌栓;29例见神经束侵犯。

1.2 方法

1.2.1 公共数据库的验证 从TCGA数据库（https：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/TCGA）下载并预处理前列腺癌数据集的mRNA表达数据，TCGA数据集中包含正常前列腺组织和前列腺癌的数据，在Human Protein Atlas数据库中验证EpCAM蛋白在前列腺癌中的表达水平。

1.2.2 试剂及免疫组化染色 所有标本均采用10%中性福尔马林固定，经脱水、石蜡包埋，4 μm厚度切片及免疫组化EnVision两步法检测。EpCAM为鼠单克隆抗体，购于北京中杉金桥公司。EpCAM为即用型试剂，具体操作步骤均按照试剂盒说明书进行。PBS代替一抗作为空白对照，采用DAB显色，苏木精对比染色。

1.2.3 免疫组织化学染色结果判定 EpCAM蛋白表达于细胞胞浆/胞膜，阴性染色属于无染色或局灶性、弱的非腔缘细颗粒染色，对染色强度及阳性细胞百分数分别进行评判。（1）按阳性肿瘤细胞百分数评分：阳性细胞数占1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，81%～100%为4分。（2）按染色强度评分：阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。将两项得分之积作为最终得分：总分0～12分，0分为阴性，1～3分为低表达，4～8分为中等程度表达，9～12分为高表达[7]。

1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0统计软件进行处理，计数资料采用率（%）表示，比较采用字2检验或者Fisher精确检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据库中前列腺癌EpCAM的mRNA及蛋白表达情况 利用TCGA的数据库分析EpCAM在52例正常前列腺组织与497例原发性前列腺癌中mRNA的表达情况，结果显示：（1）前列腺癌组织EpCAM的mRNA相对表达水平是正常前列腺组织的2.3倍（268.991/118.773）（P<0.05）;前列腺癌组织EpCAM的mRNA相对表达水平在不同种族（黑人和白人）、不同年龄（41～60岁组，61～80岁组）及不同Gleason评分组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;不同分子亚型前列腺癌EpCAM的mRNA表达水平存在差异，其中ETS家族融合ERG+、ETV1+、ETV4+亚型与SPOP、FOXA1突变亚型前列腺癌相对于正常前列腺组织表达均增加（P<0.05），并且ERG+亚型表达量高于ETV1+亚型和SPOP突变亚型（P<0.05），而FLI1+亚型和IDH1突变亚型的前列腺癌的表达量相对于正常前列腺组织差异无统计学意义（P>0.05），見图1～3。（2）利用Human Protein Atlas数据库分析494例前列腺癌EpCAM蛋白表达水平，结果显示EpCAM蛋白在前列腺癌组织内高表达，见图4。

2.2 数据库中前列腺癌EpCAM启动子序列甲基化水平 β值表示DNA甲基化水平，范围从0（未甲基化）到1（完全甲基化）。不同的β值截断被认为是高甲基化（β值0.7～0.5）或低甲基化（β值0.30～0.25）[8-9]。正常前列腺组织中EpCAM的甲基化水平β值介于0.5～0.6，前列腺癌组织中其甲基化水平β值介于0.4～0.5，前者高于后者（P<0.05），而前列腺癌组织EpCAM甲基化水平在不同种族（白人与黑人）及不同年龄（41～60岁，61～80岁）组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图5。

2.3 正常前列腺组织、原发性前列腺癌及骨转移性前列腺癌组织中EpCAM蛋白表达情况 EpCAM在正常前列腺组织、原发性前列腺癌及骨转移性前列腺癌中表达率分别为8/18（44.4%）、65/71（91.5%）、12/12（100%），并且正常前列腺组织EpCAM蛋白仅为阴性或者低表达（≤1分），而骨转移性前列腺癌EpCAM蛋白全部为高表达（≥9分），EpCAM在三种组织中表达差异有统计学意义（字2=30.06，P=0.000）。见表1。

2.4 前列腺癌中EpCAM表达与各临床病理指标间的关系 49例根治性前列腺癌的临床病理分期、Gleason评分、血管侵袭及淋巴管浸润情况，见表2。对EpCAM蛋白水平与前列腺癌各临床病理参数进行统计分析，结果表明：EpCAM蛋白表达在不同T分期及不同Gleason评分中比较差异均有统计学意义（P<0.05），即肿瘤T分期与Gleason评分越高，EpCAM蛋白表达越高;脉管浸润与神经束侵犯组较对应阴性组EpCAM蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

本研究所提供的数据分为数据库数据和收集的临床标本数据，数据库中包括正常前列腺组织和原发性前列腺癌组织，笔者所收集的标本包括正常前列腺组织、原发性前列腺癌及骨轉移性前列腺癌。数据库数据比较详尽地分析了EpCAM的mRNA表达水平与前列腺癌患者的种族、年龄、Gleason评分及其不同分子亚型之间的关系，同时数据库还提供了前列腺癌EpCAM的蛋白质表达水平及DNA启动子序列甲基化情况，本研究又把前列腺癌中EpCAM的蛋白质表达情况及其与临床病理特征之间的关系分析一次。

目前关于EpCAM的研究不仅限于细胞黏附，还包括干细胞信号传导、细胞迁移、增殖和分化[10]。关于其对细胞增殖的影响在几种头颈部癌症模型中得到证实[11-13]，而且在乳腺[14]、结直肠癌以及肺癌等肿瘤中也得到验证[15]。近年来越来越多的数据表明，EpCAM是一个有用的生物标记物，用于肿瘤干细胞的鉴定与分离，或与各种肿瘤中的“干细胞”有关[16-17]。EpCAM是一种跨膜糖蛋白，在包括前列腺癌在内的许多癌症中高度表达[4，18]。

DNA CpG甲基化参与了基因表达及发育和稳态过程中的调控，甲基化水平改变被认为是人类肿瘤发生的早期事件，可能导致基因表达变化，包括由于CpG岛（或富含CpG）启动子DNA超甲基化引起的基因沉默和由于启动子的DNA低甲基化引起的基因激活[19]。分析数据库数据，发现正常前列腺组织与前列腺癌组织中EpCAM的启动子序列甲基化水平有明显差异，即正常前列腺组织EpCAM甲基化水平高于前列腺癌组织，这一结论在一定程度上阐明了前列腺癌组织内EpCAM表达异常的可能机制。

在本研究中笔者通过免疫组化方法检测了EpCAM蛋白在正常前列腺组织、原发性前列腺癌及骨转移性前列腺癌组织中的表达，进一步研究EpCAM在前列腺癌转移和进展中的作用，实验数据一定程度上验证数据库数据，即EpCAM在前列腺癌组织中蛋白表达量明显高于良性前列腺组织，尤其在伴骨转移的前列腺癌组织中表达更高，一方面证实EpCAM在前列腺癌进展中发挥重要作用，即促进前列腺癌远处骨转移;另一方面诠释了前列腺癌容易发生骨转移的可能机制。

关于前列腺癌组织EpCAM表达与临床参数之间的关系存在相互矛盾的报道。有研究表明前列腺癌EpCAM表达与Gleason评分、根治后进展无显著相关性[20]，也有研究者通过组织微阵列方法证实EpCAM的过表达与高Gleason级存在显著相关[21]。笔者研究证实EpCAM的表达水平与前列腺癌Gleason评分密切相关，这一点与数据库数据结论不一致，同时EpCAM蛋白表达水平与前列腺癌的临床T分期密切相关，即EpCAM的高表达与高级别前列腺癌、高的临床T分期有关，这些都是前列腺癌的不良预后因素。同时笔者研究还发现EpCAM蛋白在骨转移性前列腺癌组织中表达更高，进一步说明EpCAM可能在前列腺癌骨转移过程中发挥重要作用，当然，本研究收集的骨转移性前列腺癌标本有限，今后笔者有必要加大样本含量进一步验证两者之间的相关性。

最近Tayama等[22]一项研究证明EpCAM过表达是卵巢癌化疗耐药的独立危险因素，与顺铂诱导的低水平凋亡作用有关，在卵巢癌中受EpCAM-bcl2轴的调控，即降低EpCAM水平可下调bcl-2表达，同时又上调bax的表达。另一项研究发现，在小鼠模型中EpCAM抗体可以针对EpCAM+抗化疗的白血病亚群体，表明EpCAM是一种很有前途治疗白血病的新靶点[23]，未来需要进一步研究EpCAM是否能成为前列腺癌靶向治疗的突破点。

本实验中生物信息学分析为笔者研究前列腺癌EpCAM蛋白的表达提供了重要基础，因此更加全面的了解前列腺癌中EpCAM基因的表达情况及其可能的机制。综上所述，EpCAM与前列腺癌的发生及进展有密切关系，对其深入的研究可帮助笔者进一步揭示其在前列腺癌中的功能及作用机制，从而为前列腺癌的治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2019-03-25） （本文編辑：周亚杰）