长沙某医院结核分枝杆菌耐药基因分布情况分析

潘建华，石国民，马小华，向延根

(长沙市中心医院检验科，湖南长沙 410004)

WHO 2016年结核病报告指出，我国结核病患者数量居世界第3位，是世界上30个结核病高负担国家之一[1]。据WHO估算，中国每年新发结核病患者数量多达900 000例，每年新发耐多药结核病患者70 000例。耐药结核分枝杆菌(MTB)的传播是防控结核病的主要威胁之一，治疗每例耐多药结核患者的费用是治疗药物敏感患者费用的20倍。快速检测MTB及其耐药性可精准治疗患者，缩短病程，减轻患者痛苦，有效降低耐药菌株的传播。为了解本院MTB的耐药基因ropB、KatG和inhA流行病学情况，探索适合本院快速筛选MTB耐药菌株的方法，本研究对本院2014年7月至2017年3月基因芯片技术检测MTB耐药基因的数据进行了回顾性分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2014年7月至2017年3月分离的MTB 1 981株。

1.2仪器与试剂 北京奥博生物生产的Extractor36核酸快速提取仪、HybSet基因微阵列芯片杂交盒、SlideWasherTM8芯片洗干仪和LuScan10K-B微阵列芯片扫描仪等；PCR扩增仪为美国ABI 7300；MTB耐药基因检测试剂由北京博奥生物生产。

1.3方法

1.3.1核酸提取 从Middlebrook7H9液体培养基中吸取相当于1个麦氏单位浊度的菌悬液15 μL于核酸提取管中，加入80 μL核酸提取液试剂，于Extractor36核酸快速提取仪振荡5 min，95 ℃金属浴5 min，5 000 r/min离心1 min，将收获的核酸提取液放置于-20 ℃暂存。

1.3.2核酸扩增 PCR扩增试剂1、2和3平衡至室温，瞬时离心至管底，分装成每管18 μL，分别加入模板DNA 2 μL。扩增程序:37 ℃ 600 s;94 ℃ 600 s;94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10个循环；72 ℃ 420 s；置于冰水浴中。

1.3.3芯片杂交 按9 μL杂交缓冲液加3 μL扩增产物的比例配制杂交反应物，加热至95 ℃变性5 min，立即冰水浴5 min。产物1为产物对照，与2种微阵列均进行杂交。产物2为rpoB基因的扩增产物，与利福平微阵列相对应；产物3为katG基因及inhA基因启动子的扩增产物，与异烟肼微阵列相对应。取13.5 μL混合液加入杂交芯片加样孔中，置入HybSet芯片杂交盒中50 ℃杂交2 h。

1.3.4洗涤、干燥及扫描 依次以2×标准枸橼酸水(SSC)+0.2%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.2×SSC各振荡洗涤3 min，800 r/min离心5min，甩干后扫描、判读结果。

1.3.5质量控制 每次扩增时均使用阳性对照和阴性对照，其中阳性对照可用于PCR 扩增和杂交过程的质控，阴性对照可用于监测环境及操作过程中的污染情况；每张芯片上均设置空白对照、阴性和阳性内对照、表面化学质控探针、杂交阳性外对照探针及野生型探针，用于监控杂交过程。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析,计数资料以率(%)表示，采用描述性统计分析。

2 结 果

2.1一般情况 2014年7月至2017年3月共检测MTB耐药基因患者1 981例，其中男1 330例(67.14%)，女651例(32.86%)，除30～<40岁年龄组男女比例相当外，其余各年龄组男性均明显多于女性。见表1。

表1 不同性别、年龄结核病患者情况比较[n(%)，n=1 981]

2.2MTB ropB耐药基因检出结果 1 981株MTB经基因芯片技术检测为ropB野生型1 646株，突变型335株，突变率为16.91%(335/1 981)。共检测耐利福平rpoB基因6个位点，突变类型13种。突变位点突变率由高至低依次为531[50.75%(170/335)]、516[21.19%(71/335)]、526[17.0%(157/335)]、511[14.33%(48/335)]、513[2.69%(9/335)]、533[2.39%(8/335)]。突变型分布见表2。

表2 335株耐利福平MTB ropB基因突变类型分布情况

2.3MTB异烟肼耐药基因检出结果 1 981株MTB经基因芯片技术检测共检测出KatG野生型1 670株，KatG突变株310株，突变率为15.65%(310/1 981)； inhA野生型1 913株，inhA突变型68株，突变率为3.43%(68/1 981)，9株为二者合并突变株。总突变率为18.6%(369/1 981)，其中KatG AGC→ACC突变型占所有耐异烟肼MTB突变总数的79.95%(295/369)。2个基因的突变型分布见表3。

表3 369株耐异烟肼MTB KatG和inhA基因突变谱及突变率

3 讨 论

基因芯片技术是近年来兴起的MTB耐药基因检测新技术，在国内多中心验证结果显示，该方法检测利福平耐药灵敏度和特异度为87.56%和97.95%，检测异烟肼耐药灵敏度和特异度为80.34%和95.82%[2]。基因芯片法对利福平耐药基因的检测与表型检测符合率达95.0%以上[3]。

rpoB基因突变绝大部分集中在RRDR 81 bp的密码子上[4-5]。本院531位点突变率最高，占50.75%，与青岛地区52.6%[6]接近,低于深圳的76.3%[7]；ropB基因突变率为16.91%(335/1 981)，略高于作者2016年进行的耐药表型的研究数据(13.57%)[8]，低于贵州的20.16%[9]。

异烟肼耐药相关突变发生率具有较大的地区差异性。本研究结果显示，异烟肼耐药基因KatG突变率为15.65%，inhA突变率为3.43%，二者合计异烟肼耐药基因突变率为18.6%，略高于作者2016年进行的耐药表型的研究数据(14.18%)[8]，与贵州类似[10]。KatG AGC→ACC突变率为79.95%，inhA突变率为18.7%。与青岛[6]一致，接近深圳地区的84.6%[11]，高于福州的70.7%[12]、浙江的69.3%[13]和武汉的60.9%[14]。

耐药表型与基因型之间不一致的原因可能有：(1)芯片没有覆盖所有的突变位点或突变基因型；(2)芯片检测到的突变型可能是未引起耐药的同义或错义突变；(3)传统药敏试验检测以临界水平判断耐药，而基因芯片法能检测到比传统药敏试验临界水平更低的低度耐药突变菌株。这些因素均可能对最终结果产生影响。

4 结 论

ropB基因531、516、526和511位点突变和KatG G→C突变是导致长沙市中心医院MTB利福平和异烟肼耐药的主要因素，基因芯片技术可作为本院MTB耐药基因的快速筛选方法。