比较多种细胞因子对培养的黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

鲍华烨

310000杭州市第三人民医院皮肤科

色素性疾病(包括色素沉着及色素减退疾病)是临床中最常见的皮肤病大类之一，其具体的发病机理尚不十分清楚，而黑素细胞已被公认为决定皮肤颜色的关键因素之一。黑素细胞的培养在研究色素性皮肤疾病中显得极其重要。大量研究表明，某些细胞因子对黑素细胞生物学活性有重要调控作用。既往研究显示，α-黑素细胞刺激素(α-MSH)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮素-1(ET-1)及干细胞生长因子(SCF)对黑素细胞的增殖、活性均有重要影响。基于此，本研究拟探究不同浓度的4种细胞因子对体外培养黑素细胞的影响，构建正常人表皮黑素细胞体外培养体系，分析α-MSH、bFGF、ET-1及SCF与黑素细胞的增殖、黑素的合成以及酪氨酸酶活性的关系，为临床应用提供可靠的试验依据。

资料与方法

材料和仪器：LDopa、Ham F-12培养基、人转铁蛋白、bFGF、牛胰岛素、SCF、ET-1、α-MSH、DMSO及MTT均购自美国Sigma公司，10%新生小牛血清和EDTANa2均购自美国Gibco公司，牛垂体提取物(BPE购于美国Invitrogen公司。青霉素100 IU/mL，氢化可的松0.5 mg/L，链霉素100 IU/mL，苔盼蓝，胰蛋白酶均系国内产品。培养瓶、96孔板和6孔板均购于美国Corning公司。Wellscan MK3型酶标仪(Labsystems公司)。 SYBR?Premix Ex TaqTM(日 本TaKaRa公司)，2 倍 Taq Master Mix(美国OMEGA公司)， MTS试 剂 盒 (美国OMEGA公司)。CFX96实时荧光定量PCR仪系美国Bio-Rad公司，梯度PCR仪购于德国Eppendorf公司。引物均由上海生工生物有限公司合成。经患者知情同意后，标本取自18～36岁行包皮环切术的健康成人包皮。

方法：①细胞培养：按照Halaban方法进行[1]。简述如下：取环切术切下的包皮，去除皮下组织，Dispase酶4℃消化过夜，将其表、真皮分离，用0.02%EDTA+0.25%胰酶消化表皮15 min，将其接种于培养瓶中以10个/cm2细胞密度。使用TICVA培养基于5%CO2、37℃条件下常规培养。第2天更换培养基，之后保持3次/周的更换频率进行培养基的更换。接种后的黑素细胞铺满培养瓶的瓶底时进行传代培养。进行试验取第3～4代的细胞，在试验过程中选用的培养基不含BIMX和TPA。

细胞增殖的测定：采用MTT法测定黑素细胞的增殖[2]，分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及单纯培养基各组，将其接种于96孔板中，每孔向里面加入约100μL培养基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，经4 h孵育后弃去上清液，然后向里面加入20μL DMSO将其溶解，然后置于室温条件下震荡15 min，酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处吸光值(A值)。每组设8个复孔。以药物处理组A490/对照组A490的百分数表示细胞增殖率。

细胞酪氨酸酶活性测定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及单纯培养基各组，将其接种于96孔板中，每孔向里面加入约100μL培养基，然后向里面加入20μL MTT(C=5 mg/mL)，经4 h孵育后弃去上清液，然后向里面加入20μL DMSO将其溶解，然后置于室温条件下震荡15 min，酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处吸光值(A值)。每组设8个复孔。用药物处理组A490/对照组A490的百分数表示酪氨酸酶活性。

细胞黑素含量测定：分成α-MSH、bFGF、ET-1及SCF及单纯培养基各组，将其接种于96孔板中，每孔向里面加入约100μL培养基，然后向里面加入20 μL MTT(C=5 mg/mL)，经4 h孵育后弃去上清液，然后向里面加入20μL DMSO将其溶解，然后置于室温条件下震荡15 min，酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处吸光值(A值)。每组设8个复孔。黑素含量用药物处理组A490/对照组A490的百分数表示。

研究细胞酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)mRNA表达水平：将细胞按照5×105/mL的浓度接种到6孔板中，1 d后依次选用4种细胞因子和新鲜培养基进行1次换液处理，72 h后收集细胞。按照Trizol说明书分别提取各细胞总RNA，测定RNA纯度和浓度采用紫外分光光度计。逆转录制备cDNA，RT反应条件：65℃10 min，55℃30 min，85℃5 min。PCR扩增。反应完成之后，称取反应液进行电泳处理，同时对其PCR产物加以确认。PCR扩增。real-time PCR样品经95℃预变性30 s后，按95℃5 s、60℃30 s进行40个循环，每个循环结束之前，对其荧光产物的量经由Light-Cycle系统自行检测。然后经由实时荧光定量PCR仪上获取到溶解、扩增曲线和Ct值。GAPDH基因引物(363bp)序列：F 5 "-TCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3 "；TYR基因引物(705bp)序列：F5 "-TTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCT-3 "； R 5 "-TCATCTCCTGTCAGCTTCTGGA-3 "；R 5 "-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3 "。

流式细胞术检测：细胞培养以后，依照2×105/孔将其转接到6孔板中，浓度100μg/L的α-MSH、bFGF、ET-1及SCF各处理组和单纯培养基对照组，对细胞进行72 h处理后收集各处理组的上清液，将其置于离心管中，然后向里面加入0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞(不含EDTA)，然后进行悬液的收集并将其转移到与之相对应的上清液的离心管中，以1 500 r/min行离心处理，离心时长3 min，完成后将上清液弃去，向里面加入无菌PBS重悬细胞团块，以同样条件进行离心处理，重复3次之后，将上清液弃去，向里面加入PI溶液，将其在室温条件下暗处孵育0.5 h，完成后行上机检测。

统计学分析：所测数据采用成组t检验，使用SPSS19.0统计软件进行数据处理及分析。

结 果

对黑素细胞增殖的影响：SCF试验组和单纯培养基组相比，黑素细胞的增殖未见明显的变化，两者差异无统计学意义。而bFGF、ET-1、α-MSH各试验组均比单纯培养基组黑素细胞增殖明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，该结果表明bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素细胞的增殖。

对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响：加入bFGF和ET-1的各组黑素细胞明显增强了酪氨酸酶活性和合成黑素能力，与对照组相比差异有统计学意义。且bFGF和ET-1也能明显促进黑素合成(P＜0.05)，激活酪氨酸酶(P＜0.01)。而 SCF、α-MSH 作用后，黑素细胞合成黑素能力增强，P＞0.05差异无统计学无意义，与对照组相比细胞的酪氨酸酶活性在统计学上差异无统计学意义。

对黑素细胞酪氨酸酶、TRP-1 mRNA表达的影响：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4种细胞因子作用于黑素细胞72 h后，黑素细胞酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表达均比空白培养基组的表达增加显著(P＜0.05)。其中bFGF试验组酪氨酸酶和TRP-1 mRNA的表达较其他3组表达略增多，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

黑素细胞凋亡率：bFGF、SCF、ET-1、α-MSH作用于黑素细胞72 h后用流式细胞术检测各组黑素细胞凋亡率分别为5.1%、5.6%、4.9%、5.5%，空白培养基组黑素细胞凋亡率6.8%，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

讨 论

既往研究表明，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH、肝细胞生长因子(HGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等多种细胞因子影响黑素细胞的功能[3]。在本研究中，我们选取4种公认的细胞因子，系统比较了该4种细胞因子对黑素细胞和酪氨酸酶的影响。酪氨酸酶作为合成黑素过程中最为重要的一种酶直接关系着黑素的合成。而TRP-1作为黑素体膜上的一种糖蛋白，有非常重要的作用，其能阻止未成熟的黑素细胞死亡，在黑素合成过程中起到非常重要的调节作用[4]。抑制该基因以后会抑制黑素细胞的增生，使酪氨酸酶活性下降[5]。

本研究的结果表明，bFGF、ET-1、α-MSH均可刺激黑素细胞的增殖，并且bFGF和ET-1均能提高酪氨酸酶活性，加速黑素合成。而SCF对黑素细胞的增殖无显著影响，SCF和α-MSH对黑素细胞合成黑素能力及酪氨酸酶活性均无明显作用。对黑素细胞的凋亡均无显著影响是bFGF、SCF、ET-1、α-MSH 4种细胞因子。黑素细胞的生长受细胞因子、角质形成细胞与黑素细胞间连接等多种因素调控。bFGF是成纤维细胞的一种有丝分裂原，主要作用在来源于中胚层和神经外胚层的组织细胞。研究还发现角质形成细胞、细胞因子以及黑素细胞间连接等因素与黑素细胞的生长有着紧密的关联。而bFGF作为成纤维细胞的一种有丝分裂原，其大多来源于神经外胚层和中胚层的组织细胞。相关研究显示，该细胞因子借助磷酸化的黏着斑激酶能够促进黑素细胞发生迁移[6]。α-MSH作为肽类激素的一种，其在黑素细胞的分裂过程中发挥重要的作用，该物质的前体是前阿片黑素细胞皮质激素，其对黑素的影响主要通过和MC1R发生结合后借助cAMP信号通路发挥效用。

本研究提示，bFGF、SCF、ET-1、α-MSH均可影响黑素细胞的生长和增殖，其中ET-1和bFGF都对酪氨酸酶的活性以及黑素细胞的增殖有一定的促进作用。但是对其具体作用机制还不是很了解，有待进一步研究。