高良姜中高良姜素提取纯化工艺研究

兰 月，黄利豪，刘 鹏，陈旅翼

(中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074)

1 引言

高良姜别名蜜姜、南姜、小良姜等，是姜科山姜属植物(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根茎。全国野生高良姜的主产地分布在广东、广西、海南和云南等地。高良姜性热味辛，主要有温胃散寒，消食止痛的功效，是治疗脘腹冷痛，胃寒呕吐，嗳气吞酸等症状的良好药材[1]。高良姜主要化学成分有黄酮类、糖苷类、苯丙素类、挥发油类、二芳基庚烷类。而黄酮类成分主要有高良姜素、山柰素、山柰酚、槲皮素、异鼠李素等[2]。本文探索了高良姜中高良姜素的提取纯化条件，为高良姜的进一步药理学研究提供材料，也为山姜属植物的开发利用开拓思路。

2 仪器与试剂

2.1 材料

高良姜药材购于安国市盛辉中药饮片有限公司，产地广东湛江，由中南民族大学陈旅翼副教授鉴定为高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的根。

2.2 标样与试剂

高良姜素标准品(中国药品生物制品检定所)。乙腈、甲醇(TEDIA COMPANY，INC)为色谱纯；其余试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。AB-8大孔吸附树脂：上海摩速科学器材有限公司；聚酰胺树脂(国药集团化学试剂有限公司)。色谱柱(250×4.6mm， Agilent 5 TC-C18)。

2.3 仪器

高效液相色谱仪(UltiMate3000，美国戴安公司)；旋转蒸发仪(RE52CS-1，上海亚荣生化仪器厂)；水浴锅(B-260，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(JY1002，上海浦春计量仪器有限公司)。

3 实验方法

3.1 标准曲线的制作

根据2015年版中国药典规定，设置色谱条件：流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长266 nm，以乙腈-0.2%磷酸溶液(55∶45)为流动相，进样量10 μL，进样20 min[3]。

精密称取高良姜素对照品0.0040 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度为40 μg/mL，分别依次进样1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL。按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。

3.2 高良姜素得率和含量的测定方法

将供试品过微孔滤膜(0.45 μm)，转入液相小瓶备用。按“标准曲线的制作”项下进行操作，测定峰面积，根据回归方程计算被测样品中高良姜素含量。

得率=提取物质量/药材质量×100%

3.3 提取条件单因素试验

选取药材提取的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等4个可能影响提取效果的因素做单因素实验，以确定相关因素及各因素的合适范围。

3.4 提取条件正交试验

运用正交试验设计来优化提取工艺，在单因素实验基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等4个影响较大的因素进行优化组合，考察指标为高良姜素得率和含量，因素水平见表1。

表1 因素水平

3.5 大孔吸附树脂纯化

大孔吸附树脂是一类主要应用于中草药化学成分的分离与纯化的有机高聚物吸附剂[4]。大孔吸附树脂具有稳定性高、吸附选择性独特、富集效果好、解吸条件温和、不受无机物影响、再生简便、使用周期长等优点[5]。本试验选用AB-8大孔树脂联合聚酰胺树脂对高良姜素进行纯化。

4 结果与讨论

4.1 工作曲线及线性方程

用最小二乘法进行线性回归，得回归方程为：Y=86.292X+0.1903，R2=1。高良姜素进样量在0.04 μg～0.8 μg与峰面积线性关系良好。

表2 高良姜素标准曲线方程

4.2 提取条件单因素试验

4.2.1 乙醇浓度对高良姜素得率和含量的影响

固定料液比1∶10(g/mL)，提取时间2 h，提取温度90 ℃、提取次数1次，考察不同乙醇浓度80%、85%、90%、95%，对高良姜素含量和得率的影响，结果见图1。随着乙醇浓度的增加，高良姜素得率和含量随之增大。当乙醇浓度为90%时，得率和含量皆有所下降。因为乙醇浓度较低时，提取液中蛋白质，糖类等水溶性物质大量溶出，杂质含量较高，而醇浓度过高，脂溶性的物质溶出也增多，影响高良姜素的溶出。

4.2.2 料液比对高良姜素得率和含量的影响

固定乙醇浓度90%，提取时间2 h，提取温度90 ℃、提取次数1次，考察不同料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)，对高良姜素含量和得率的影响，结果见图2。不同料液比对高良姜素含量的变化影响较小，增幅在14.40%左右。料液比在1∶6～1∶12时，得率随料液比增大而增大，而料液比为1∶10时得率降低。当料液比较小时，溶剂用量的增加会使传质力加快，有利于高良姜素的提取。从浸提效果、减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面考虑，料液比为1∶8比较合适[6]。

图1 乙醇浓度对高良姜素得率和含量的影响

图2 料液比对高良姜素含量和得率的影响

4.2.3 提取时间对高良姜素得率和含量的影响

固定乙醇浓度90%，料液比1∶8，提取温度90 ℃、提取次数1次，考察不同提取时间1、1.5、2、2.5、3 h，对高良姜素含量和得率的影响，结果见图3。高良姜素含量随着时间的增大而缓慢增大，而高良姜素含量在3 h时明显下降。高良姜素得率随着时间的增加而降低，而在1.5 h时达到峰值，这是因为时间的增大可以使高良姜素最大限度地溶出，但是时间过长会使高良姜中其它成分溶出，降低了高良姜素的含量，而且周期延长不利于生产。

图3 提取时间对高良姜素含量和得率的影响

4.2.4 提取温度对高良姜素得率和含量的影响

固定乙醇浓度90%，料液比1∶8、提取时间2.5 h、提取次数1次，考察不同提取温度60、70、80、90、100 ℃，对高良姜素含量和得率的影响，结果见图4。随着温度的升高，高良姜素的得率增大，而在80℃以后，得率减小。高良姜素含量会随着温度的升高而降低。因为温度的升高会使高良姜素在乙醇中中的溶解度增大，而温度过高，使得高良姜素遭到破坏。此外，温度过高，会使得杂质的溶出量增加，给后续的分离提纯操作带来不便。所以温度在60～70 ℃的范围内比较合适。

图4 提取温度对高良姜素含量和得率的影响

4.3 提取条件正交试验结果

由表3可以看出，各因素对高良姜素综合值影响的主次顺序为：提取温度>料液比>乙醇浓度>提取时间。确定最佳提取条件为A2B1C1D3，即乙醇浓度90%、料液比1∶6(g/mL)、提取时间1 h、提取温度80 ℃。

对正交试验进行验证，选取最优组合平行三次试验，得出平均综合值为2.00，证明采用此工艺提取高良姜酚酸合理、可行、稳定。

综合值=含量/最高含量(5.21%)+得率/最高得率(79.46%)。

4.4 大孔树脂纯化结果

按照上述试验优选出的条件进行高良姜素的提取，抽滤，旋蒸浓缩至无醇味，加入原液1/2体积的40%乙醇溶解，即得上样液。先用AB-8型大孔树脂柱吸附，得到高良姜素纯度为21.80%。再用聚酰胺树脂柱吸附，所得高良姜素的纯度为45.77%。洗脱方法皆为：用蒸馏水、30%乙醇除杂，再用50%、70%、95%的乙醇梯度洗脱，合并组分得到高良姜素。

表3 L9(34)正交试验结果

5 结论

通过正交试验确定了高良姜素的最佳提取工艺为原料重6倍的90%乙醇为溶剂，在80℃下提取1h，该工艺的得率可达到81.59%，含量可达到6.38%。AB-8大孔树脂和聚酰胺树脂联用进行纯化后，所得高良姜素的纯度为45.77%。