现场快速检测在感染性疾病领域的应用*

杨 洋 肖 盟 杨文航 张 戈 张京家 段思蒙 康 巍 王 瞳 徐英春*

实验室检验在感染性疾病的预防、诊断和治疗过程中均起着举足轻重的作用，现场快速检测(pointof-care testing，POCT)作为一个新兴的检验技术，受到越来越多的关注。美国病理学家协会(College of American Pathology，CAP)定义POCT为“用于在患者所在地开展、不需要永久性固定场所、可在临床实验室区域以外进行的检测项目”[1]。通过阐述POCT的医学价值、技术特点以及应用现状，综述POCT在感染性疾病领域的应用。

1 感染性疾病POCT的诊断意义

POCT具备实验室仪器小型化、操作方法简单化和结果报告即时化的特点，在感染性疾病诊断方面具有诸多优势[2-3]。

1.1 为重症感染针对性治疗提供依据

由于传统实验室诊断方法耗时较长，目前医院收治重症患者后，主要根据患者临床症状，联合一种或数种广谱抗生素进行经验性治疗，而尽早确定感染病原种类，可指导临床开展更有效的目标性治疗。同时，一些分子POCT方法可检测部分病原的常见耐药机制，避免临床采用错误的治疗方案。

1.2 提高感染性疾病诊疗效率

在社区医院中，常见的由A群链球菌引起的咽炎、衣原体感染乃至淋球菌感染，利用POCT方法可快速甄别此类患者并指导正确治疗，避免门诊患者随访失联、或加重患者及临床进一步诊疗的工作量与经济负担。

1.3 协助医疗机构院内感染控制

医院的发展面临成本效益的挑战，而院内感染控制是医疗机构成本控制中极为重要的环节。POCT技术已被应用于院内感染监测，可协助临床及相关管理部门快速识别潜在传染源，以采取有效措施切断病原传播途径。

2 感染性疾病POCT的诊断方法与平台

2.1 POCT方法

Peeling等[4]的研究中，将POCT的价格低廉(affordable)、敏感(sensitive)、特异(specific)、用户友好(user-friendly)、快速(rapid)、不需设备(equipment-free)和便于应用(deliverable)缩写为“ASSURED”，提出临床对POCT方法学的期望。

最早应用于感染性疾病的POCT方法是酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)中的侧流免疫层析法，应用领域涵盖细菌、病毒、真菌以及寄生虫诊断。该方法的检测试剂条上携有结合了信号标记(如金标或荧光标记)的检测抗体，可与临床样本中的特定病原抗原相结合，之后抗原-抗体复合物在裂解液或毛细管作用下在固相底物上前移并产生可检测信号。

酶免疫夹心法是基于酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法改良而来，所检测抗原需≥2个不同的抗原表位，分别用于结合捕获与信号抗体形成三明治结构。该方法被广泛应用于A群链球菌、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)和肝炎病毒的检测，检测时间5～30 min，使用肉眼或小型读取仪对显色或荧光信号进行结果读取与判定[5-6]。由于其成本低廉且不依赖专业人员操作，快速EIA检测方法在临床实验室使用广泛，但与其他更为复杂、精准的实验室检测方法相比，POCT的EIA方法在特异性和敏感性方面有所差距，同时，操作者肉眼读取可能造成假阴性或假阳性[7-8]。

为弥补EIA方法存在的缺陷，核酸扩增试验(nucleic acid amplification tests，NAAT)方法开始应用于POCT领域[9-10]。由于使用病原特异性的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)探针，使用NAAT技术进行疾病检测与诊断的可靠性更高。

医学检验实验室中，分子检测方法已成为许多种类感染性疾病诊断的“金标准”，但传统聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法操作过程复杂且成本较高，需使用较大型的核酸扩增与检测设备，不能满足POCT需求。新近NAAT技术的发展，克服了既往分子检测相关使用的局限性，其中最具代表性的是恒温扩增技术(isothermal amplification)的出现与应用。如环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术借助新型聚合酶以及反应体系设计，可实现60～65 ℃恒温条件下待测物的扩增，极大降低了检测对仪器的依赖性，降低了成本和操作复杂性，并已应用于结核、疟疾等重大传染性疾病的检测[1，9-10]。

2.2 POCT平台

目前，POCT方法的检测平台向2个方向发展：①传统实验室大型检测设备的小型化，同时着重加强平台的自动化设计，降低对人员操作水平的要求；②单次使用的手持型设备得益于微制造技术领域的进步，此类设备目前已将复杂的样本处理、试剂储存、检测反应及结果读取等模块集中于很小的平台空间中。随着科学技术尤其是信息与网络技术的发展，目前有更多新型的POCT平台，如基于手机的疟疾涂片阅片系统[11]正不断投入研发与应用。

3 POCT在感染性疾病中的应用

3.1 化脓性链球菌检测

美国感染性疾病学会的数据显示，每年因咽炎就诊的患者达1500万人次，而化脓性链球菌是引起咽炎重要的病原之一，在儿童患者中占比可达30%[12]。目前针对化脓性链球菌的POCT检测方法有很多，其中最常用的仍为侧流免疫层析法，总体灵敏度可达76%～83%[13-14]。多项研究表明，使用POCT方法快速检测化脓性链球菌可有效降低咽峡炎以及下呼吸道感染中过度处方的情况[15-16]。

3.2 隐球菌抗原检测

通过乳胶凝集试验或侧流免疫层析法检测隐球菌荚膜多糖抗原(cryptococcal capsular polysaccharide antigen，CrAg)是国际上广泛应用的检测方法。目前大部分CrAg检测仍在临床实验室进行，但世界卫生组织(World Health Organization，WHO)建议，由于该方法快速、成本低廉、操作简便及对操作人员要求低，可作为POCT进行开展[10，17]。近期一项研究表明，在资源有限地区，使用指血进行CrAg的POCT技术可有效进行患者分层[18]。WHO建议，在隐球菌流行区域，CD4细胞计数＜100 细胞/ml的HIV患者在抗病毒药物使用之前应进行CrAg筛查[17]。

3.3 HIV检测

HIV快速检测是POCT在感染性疾病领域应用时间最长且最为成功的案例之一。目前，市场上已有大量基于侧流免疫层析法的HIV快速检测产品，可用于指血全血、静脉全血、血浆或口腔标本的检测，且第四代HIV的POCT产品已获得批准，可同时进行HIV抗原与抗体检测。有研究表明，第四代HIV快速检测产品与参考实验室方法相比，灵敏度可达91%～100%[19-20]。此外，基于NAAT的HIV-1和HIV-2检测方法也已问世，仅需25 μl全血或血浆样本即可完成POCT检测[21]。HIV快速检测产品的普及应用，可协助患者确诊以尽早的抗病毒治疗，同时从公共卫生层面可通过有效的指向性干预减少HIV传播的发生[22]。

3.4 性传播疾病检测

常见引起性传播疾病(sexually transmitted diseases，STD)的病原包括沙眼衣原体、人乳头瘤病毒、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫、梅毒螺旋体及单纯疱疹病毒等。STD出现长期症状之前，会有一段无症状期，因此，需要可靠的筛查方法。在较为贫穷的国家及地区，由于缺乏医学实验室平台的支撑，仅凭公共卫生干预很难在降低STD发生率方面取得显著成果，而POCT方法的应用恰恰可以改善这一状况[23]。

目前可用于STD检测的POCT试剂种类与品牌众多，其中大部分仍基于侧流免疫层析原理，然而使用该类技术独立进行STD诊断的效能仍有待提高。近期一项针对淋病奈瑟菌与阴道毛滴虫侧流免疫层析类POCT检测方法的报道中，不同研究得出的方法学灵敏度在12.5%～100%之间，特异度在38%～98%之间，差异较大；NAAT方法在一定程度上提高检测性能，如Cepheid公司GeneXpert CTNG试剂盒是一种基于多重PCR的沙眼衣原体与淋病奈瑟菌快速检测方法，特异度和灵敏度均达到95%以上[24]。然而，2017年发表的一项临床研究指出，即使该技术可以很快完成检测，但仍有78%以上的患者在获得检测报告前已经离院[25]。因此，POCT在STD疾病检测领域中仍需进一步优化与发展。

3.5 流感检测

快速流感检测是POCT在临床微生物领域另一种最为广泛的应用，包括美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)在内的管理机构与学术组织均推荐流感症状出现48 h内开始抗病毒治疗，以降低病死率、缩短病程并降低病毒二次传播的风险[26]。目前，EIA仍是最常用的流感POCT方法。在美国，超过60%的医疗机构仅以EIA作为流感患者筛查手段[26]；然而不同研究表明，该方法的检测灵敏度仅有30%～90%，因此极可能发生漏检[5，27]。新型分子技术的引入在提高准确度与保障检测速度方面找到了平衡点，在美国已获得POCT许可的分子检测方法包括Roche Cobas Liat Influenza A/B试剂盒和Alere Influenza A/B试剂盒2种，均可由非实验室人员在急诊或医生诊室中操作使用。

3.6 结核分枝杆菌检测

结核分枝杆菌作为全球重点关注的传染性疾病之一，其感染的检测仍极大程度地依赖于传统微生物实验室的显微镜检或培养方法；然而前者敏感性不佳、后者耗时过长。自20世纪90年代美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准首个NAAT方法应用于结核分枝杆菌检测[28]以来，Roche及Seegene等大型诊断公司亦在美欧等地推出了结核分枝杆菌的分子诊断方法，有效提高了检测敏感性，缩短了检测时间[29-30]。

尽管市场需求巨大，目前唯一被批准用于POCT的结核分枝杆菌分子诊断方法仅Cepheid GeneXpert MTB/RIF一种。Lessells等[31]研究表明，与将样本送至实验室进行分子检测相比，使用GeneXpert MTB/RIF方法进行POCT检测，患者开始正确抗结核治疗的时间中位数可由7 d缩短到1 d，且效果显著。

3.7 医院感染控制

医院感染控制主要关注的病原包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus a u r e u s，MRSA)感染、万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistant enterococci，VRE)感染、碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(carbapenemresistant enterobacteriaceae，CRE)感染和艰难梭菌(clostridium difficile，CD)感染等。快速甄别相关耐药病原菌感染乃至定植的个体，进而借助隔离、消毒及去定植等方法，可有效控制传播源，避免耐药菌在医疗机构内播散[32]。目前，美国已有针对MRSA的POCT检测方法被批准。美国North Shore医院数据表明，通过开展快速MRSA筛查，医院获得性MRSA的发生率降低了69%以上[33]。然而，Wu等[34]研究发现，通过POCT对MRSA进行广泛筛查虽然可以有效缩短病原检出时间，但对MRSA的实际发生率并无显著影响。相关研究均指出，医院感染控制是一项综合性工程，除病原检测以外，其他防控措施在控制耐药发生率方面也极为重要。

CD是另一种在欧美受到极大关注的耐药病原菌。传统的临床实验室检测依赖于EIA技术检测粪便标本中的CD毒素，敏感性不足；而新型分子生物学方法针对其毒素基因进行检测，具有更好的特异性及敏感性[35]。但尚未有POCT方法在美国获批。Goldenberg等[36]研究中，将Cepheid GeneXpert CDI进行POCT科研应用：在22个月的研究期间，CD检测结果的回报时间中位数由需要送至临床实验室检测的18 h降低到POCT的1.8 h，同时检测一致率达到98%。Schechner等[37]研究表明，通过CD快速检测后对患者进行单间隔离，使CD感染的发病率在350张床位中由9.4例/d下降到8.5例/d，同时保证了科室运行的成本效益。

医院感染其他重要耐药病原菌的感染控制受益于快速检验检测方法的应用，但相关产品(绝大多数为分子诊断产品)仍处于研发或评估阶段，尚未有获得POCT批准的项目。

4 展望

POCT技术的应用，为实验室、临床乃至社会带来重大变化。相信随着技术的进步，更多先进的快速检验技术，如针对感染症候群的小型自动化分子生物学快速检测平台，已准备进入POCT应用阶段。然而需要意识到，POCT检测在质量控制、应用场所等方面仍存在诸多挑战，未来仍需更多的科学研究以及卫生经济学评价，支持POCT领域的持续性创新发展。