6种根瘤菌系统发育分析及其耐硒能力

成永丽，陈 健，杨 琳，杨 凡，雷梦成，傅 琴，周毅峰，唐巧玉

(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北民族学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

【研究意义】根瘤菌(Rhizobia)，是一类存在于土壤中的革兰氏阴性细菌[1]。其能够侵染豆科植物的根部或茎部，形成根瘤，并将空气中的氮气还原成氨类物质为豆科植物的生长提供氮素营养，而根瘤菌需要的能源和碳源则来源于其宿主植物。二者结合的共生体系具有高效、无污染的特性，研究和开发利用这一固氮体系具有巨大的生态、经济和社会价值。尽管根瘤菌可能有共同的祖先，但是由于在长期进化过程中，受宿主选择和环境的影响，分别向不同方向进化，形成了丰富的生物多样性，其多样性的研究成为目前生物固氮的热点领域[2]。【前人研究进展】根瘤菌遗传多样性是指种群间和个体间的遗传变异，在多样性基础上，测定各遗传群的代表菌株的保守基因16S rDNA序列，从而确定菌株的系统发育地位[3]。在各种分子标记技术中，16S rDNA由于具有信息量大、保守性强、普遍性及检测快速简便的特征被称为“分子进化钟”，同时被作为系统分类最合适的指标[4]，是构建细菌系统发育树的基石。研究慢生根瘤菌发现，其表型和遗传特性等方面存在明显的差异，而各个菌株间16S rDNA基因序列的差异表现较小[5]。因此，16S rDNA的基因序列分析是根瘤菌系统发育和分类研究的重要手段。豆科(Leguminosae)属于被子植物的第三大科，包括含羞草亚科、云实亚科和蝶形花亚科，分布范围广[6]。目前，全世界已知的豆科植物约750余属19 000多个种，我国约185属1500余种，并且还有许多豆科植物在不断的被收录和记载[7]。而黄芪属植物多为富硒植物(如紫云英)[8]，同时大豆也为富硒植物[9]。湖北恩施州地处武陵山区，其海拔落差大，小气候特征明显，垂直差异突出，物种资源丰富。境内蕴藏有独立的硒矿床，被誉为“世界硒都”，是我国迄今发现的第一个富硒区。【本研究切入点】本研究通过16S rDNA基因全序列分析，分别对湖北恩施富硒地带的竹山紫云英根瘤菌、炼铁湾紫云英根瘤菌、渔塘坝紫云英根瘤菌、曾家紫云英根瘤菌以及低Se大豆根瘤菌和高Se大豆根瘤菌进行了分离鉴定和系统发育研究。【拟解决的关键问题】探讨它们的亲缘及进化关系，并初步探索了其耐硒能力，对丰富根瘤菌资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

6个植物样品来源：4 株紫云英(Astragalussmicus)来源于四个不同富硒地点，分别为湖北宣恩县椿木营乡挖断山村、湖北恩施市新塘乡双河炼铁湾、湖北恩施市新塘乡双河渔塘坝和湖北宣恩县椿木营乡挖断山村曾家；低Se大豆(Glycinemax)盆栽种植于低硒普通土壤；高Se大豆盆栽种植于采自湖北恩施渔塘坝的富硒土壤中。

克隆载体：pMD19-T；感受态细胞：E.coliDH5α。

1.2 设备与药品

1.2.1 主要药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氢氧化钠、乙酸钠、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯仿、苯酚、异戊醇、异丙醇、氯化钠、无水乙醇、葡萄糖、溴化乙锭、琼脂粉，氯化钙，磷酸氢二钾、七水硫酸镁、甘露醇、硼酸等。

EasyTaqBuffer、EasyTaq酶(TaKaRa)、dNTPs、ddH2O、P1、P6、SolutionⅠ、pMD19-T、X-gal、IPTG、氨苄青霉素、6×Loading Buffer、SalⅠ酶(TaKaRa)、BamHⅠ酶(Thermo Scientific)、10×Buffer Tango 、RV-M、M13-47、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker。

1.2.2 培养基 YMA培养基：用于根瘤菌的培养。甘露醇 5.0 g；K2HPO4·3H2O 0.25 g；MgSO4·7H2O 0.1g；酵母粉 0.5 g；NaCl 0.05 g；CaCl20.025 g；Rh微量元素 2 mL，ddH2O补齐至500 mL。沸五次，冷却至55 ℃左右调pH至6.8～7.0，分装，高温高压灭菌。固体培养基则在YMA液体培养基中多加入6.5 g的琼脂粉。

LB培养基：用于大肠杆菌的培养。胰化蛋白胨 10 g；酵母粉 5 g；NaCl 10 g；pH 7.0，ddH2O定容至1 L。LB固体培养基则在1 L的LB液体培养基中加入15 g的琼脂粉。

培养基用去离子水配制后，121 ℃灭菌20 min。

1.3 实验方法

1.3.1 根瘤菌的分离、纯化 选取个大而饱满的根瘤，用剪刀将其剪下(带部分根)，将根瘤放在清水中浸泡4～5 min，洗去杂质，再用95 %酒精浸泡5 min后，用0.1 %的升汞表面灭菌5 min，然后用无菌水冲洗6次。无菌操作下，将单个根瘤用灼烧冷却后的解剖刀切成两半，切面在YMA培养基平板上划线，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养5 d左右后，选择较典型的单一菌落分别在YAM平板上划线，继续培养观察，如果菌落无异常，再划线稀释反复分离，直到纯化为止。

1.3.2 根瘤菌16S rDNA克隆 目的基因扩增。CTAB法提取细菌总DNA[10]。扩增引物用来源于E.coli16S rRNA基因序列保守区域的序列合成引物P1(正向引物P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3′)和P6(反向引物P6：5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3′)[13]。

PCR扩增体系： ddH2O 18.3 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTPs 2.0 μl，P10.5 μl，P60.5 μl，模板1.0 μl，Pfu酶0.2 μl，总体系25 μl。加入以上体系后，漩涡混匀，最后离心5 s左右。

M.Marker，1.竹山，2.炼铁湾，3.渔塘坝，4.低硒，5.高硒，6.曾家;A.菌株基因组DNA，B.16S rDNA序列扩增M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia;A.Genome DNA of rhizobium, B.16S rDNA sequence amplification 图1 菌株基因组DNA和16S rDNA扩增Fig.1 The genomic DNA and 16S rDNA sequence electro-photogram of strain

PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30个循环；72 ℃最终延伸6 min；4 ℃保持，最后电泳检测结果。

目的基因克隆测序。将目的基因连接到克隆载体pMD19-T上，并转化E.coliDH5α感受态细胞。重组子的筛选与鉴定采用IPTG/X-Gal平板法、菌落PCR筛选法和双酶切法。其中菌落PCR所用的引物则是通用引物M13-47和RV-M，SalⅠ和BamHⅠ对重组质粒双酶切筛选。将所筛选的6个阳性克隆质粒送武汉伯尔生物科技有限公司进行双向测序。

1.3.3 分子系统发育树构建 利用Vector NTI 11.5.1 软件中去除P1、P6引物序列，结代表性根瘤菌菌株的16S rDNA序列，应用Mega7.0生物软件构建系统发育树。

1.3.4 根瘤菌耐硒能力分析 竹山、炼铁湾、渔塘坝紫云英根瘤菌分别在硒浓度为1～8 μg/mL的平板上划线培养，低Se、高Se大豆根瘤菌和曾家紫云英根瘤菌则分别在硒浓度为0.1～6 μg/mL的平板上划线培养。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增

对不同地区的根瘤菌进行总DNA的提取，并进行16S rDNA序列扩增，从图1可以看出，经RNase酶消化后的DNA条带清晰，大小在8000 bp以上。16S rDNA序列扩增条带大小在1500 bp左右。与所查文献相一致。

2.2 16S rDNA克隆检测

2.2.1 菌落PCR检测 将16S rDNA序列扩增产物与pMD-19T连接，热激法转化DH5α感受态细胞于含有IPTG、X-gal 的LB平板中培养，挑取平板中的白色阳性克隆菌落进行菌落PCR鉴定，结果见图2～3。在平板上转化的重组质粒生长较好，无杂菌污染，且菌落大多呈白色，也有少量的蓝色菌落，说明转化效率较高，转化成功。菌落PCR检测出了6个包含单一条带的阳性克隆。

2.2.2 酶切鉴定 为进一步确定阳性克隆，碱提法抽提6个菌落PCR阳性克隆的质粒，用SalⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定，由于2种酶来自不同的公司，故用通用Buffer(Tango Buffer)进行酶切，结果见图4B。6个菌落质粒抽提图谱(图4A)，有3条带呈现，因为质粒存在3种形态，即超螺旋、开环、线性，说明抽提效果较好，都可以用于测序分析。

2.3 6种根瘤菌系统发育树的建立

将6个阳性克隆质粒送往武汉伯尔生物科技有限公司进行双向测序，通过Vector NTI软件进行序列拼接，去除载体序列和16S rDNA引物，得到的片段长度均为1390 bp左右。

M.Marker，1.竹山，2.炼铁湾，3.渔塘坝，4.低硒，5.高硒，6.曾家M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia图2 菌落PCR检测Fig.2 Colony PCR detection

A. 竹山；B. 炼铁湾；C. 渔塘坝；D. 低硒；E. 高硒；F. 曾家A.Zhushan; B.Liantiewan; C.Yutangba; D.Dixi; E.Gaoxi; F.Zengjia图3 重组子转化Fig.3 Recombinant transformation

A.质粒DNA，B.酶切鉴定；M-Marker，1.竹山，2.炼铁湾，3.渔塘坝，4.低硒，5.高硒，6.曾家 A.Plasmid DNA, B.Enzyme digestion identification；M.Marker,1.Zhushan,2.Liantiewan,3.Yutangba,4.Dixi,5.Gaoxi,6.Zengjia)图4 质粒DNA和酶切鉴定Fig.4 Plasmid DNA and enzyme digestion identification

根据根瘤菌的分类，在NCBI查找相应的种属序列，采用Neighbour-Joining 模型，确定分离出的6种根瘤菌的分类地位，结果见图5。竹山、炼铁湾、渔塘坝紫云英根瘤菌供试菌株归属土壤杆菌属(Agrobacterium)、低硒大豆根瘤菌供试菌株归属慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、高硒大豆根瘤菌供试菌株归属中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、曾家紫云英根瘤菌供试菌株归属根瘤菌属(Rhizobium)。

2.4 6种根瘤菌的耐硒浓度

竹山、炼铁湾、渔塘坝、曾家紫云英根瘤菌在不同硒浓度下培养40 h，其耐硒能力分别为6、6、6、6、5 μg/mL，而低硒、高硒大豆根瘤菌分别培养4 d+2 h、2 d+16 h，其耐硒能力均为3 μg/mL(图6～11)。

3 讨 论

生物固氮占全球植物所需氮素的75 %, 而在生物固氮体系中, 限于豆科植物的共生固氮体系效率最高，豆科植物-根瘤菌固氮系统每年固定约5 000万吨的氮营养[11]。因此，研究人员不断地研究根瘤菌的多样性及生活习性等方面，发现了越来越多的新种：从1932 年的1 属6 种，增加到现在的17 属近100 种[12]；而且新的根瘤菌物种还在不断地被发现，而本文从不同样本中分离得到的根瘤菌归属于已有的不同属别，对于其种的鉴别还需系一部进行。与大豆结瘤的根瘤菌主要是慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属[3]，本研究中2株大豆根瘤菌分别归属于慢生根瘤菌属(低硒大豆根瘤菌供试菌株)和中华根瘤菌属(高硒大豆根瘤菌供试菌株)，这与前人研究一致。管风贞[13]利用16S rDNA进行序列分析，确定紫云英根瘤菌的系统发育地位分属于中慢生根瘤菌属、黄单孢菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属等，本研究中4株紫云英根瘤菌分属于其中的土壤杆菌属和根瘤菌属。

图5 基于邻接法构建的16S rRNA全序列系统分类树状图Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences using neighbour-joining method

A～C：硒浓度为5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7 μg/mL图6 竹山根瘤菌Fig.6 Zhushan rhizobium

A～C：硒浓度为5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7μg/mL图7 炼铁湾根瘤菌Fig.7 Liantiewan rhizobium

A～C：硒浓度为5～7μg/mLA-C: The selenium concentration is 5-7μg/mL图8 渔塘坝根瘤菌Fig.8 Yutangba rhizobium

尽管分离得到的根瘤菌归属到了已有的属别，但本文从它们的耐硒能力方面着手，得到了不同根瘤菌有不同耐硒能力的实验结果。从各菌株的耐硒能力来看，高硒自然环境下生长的根瘤菌有较强耐硒能力。同时，紫云英根瘤菌的耐硒能力高于大豆根瘤菌。因为大豆和紫云英根瘤菌分属不同的属别，这也间接说明不同属别的根瘤菌具有不同的耐硒能力。这些结果丰富了根瘤菌生理特性研究，从而拓宽根瘤菌的应用范畴。据文献报道[14]，接种根瘤菌能促进超聚硒植物黄芪对硒的吸收；Pilon-Smits等[15]研究了土壤生态环境与双沟黄芪超聚集硒之间的关系，发现超聚硒植物与生态伙伴对硒的抗性有关，生态伙伴其中就包括共生细菌。本文筛选出来的部分耐硒根瘤菌，与宿主植物共生后，是否具有更强的促进植物硒吸收的能力，或者是否能提高植物对髙硒环境的抗性，也需要进行进一步的研究。

A～C：硒浓度为4～6 μg/mLA-C: The selenium concentration is 4-6 μg/mL图9 曾家根瘤菌Fig.9 Zengjia rhizobium

A～C：硒浓度为2～4 μg/mLA-C: The selenium concentration is 2-4 μg/mL图10 低硒根瘤菌Fig.10 Dixi rhizobium

A～C：硒浓度为2～4 μg/mLA-C: The selenium concentration is 2-4 μg/mL图11 高硒根瘤菌Fig.11 Gaoxi rhizobium

4 结 论

本研究分离得到6个根瘤菌菌株，分属4个不同的属别，分别为土壤杆菌属(Agrobacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、和根瘤菌属(Rhizobium)。在高硒自然环境(竹山、炼铁湾、渔塘坝、曾家)下生长的根瘤菌有较强耐硒能力，紫云英根瘤菌的耐硒能力高于大豆根瘤菌。