微波辐照对牙周膜细胞中白细胞介素6 的影响

陈晔 谢文泵 庄文捷

白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是一种细胞因子，它的来源很广泛，其生物学活性多样，在机体的炎症反应及免疫应答中发挥着至关重要的作用[1-2]。许多研究表明，白细胞介素-6的表达在病变的牙周组织中广泛的存在，并且明显高于在正常牙周组织中的表达[2-3]。IL-6的表达水平已经成为牙周组织破坏程度的指标，诱导牙周组织血管内皮生长因子表达，炎症细胞增多及能量消耗，从而加重炎症反应。牙周炎症时患牙龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）中IL-6的水平比正常牙中高出许多，并且牙周组织的破坏和牙周疾病的严重程度与IL-6的水平成正比关系[3-4]。本研究的目的是比较在微波治疗后人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）IL-6的水平的变化，为临床使用微波来治疗牙周疾病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要器材和试剂

青-链霉素混合液（Hyclone，美国），DMEM低糖培养基（GIBCO,美国），胎牛血清（GIBCO，美国） 胰蛋白酶（GIBCO，美国），MTS（Promega， 美国），二甲基亚砜（Sigma,美国），酶联免疫检测仪（Biotek POWERWAVE，美国），微波治疗仪（新技术研究所，南京），人白细胞介素6 ELISA 试剂盒（欣博盛，深圳）。

1.2 标本取材及原代培养

收集2018年7月医院口腔科门诊12～17岁因正畸治疗而拔除的健康前磨牙10颗（共5位患者，征求患者及家长同意），要求患者术前用3%H2O2漱口，然后口内及口周分别使用75%的酒精消毒，拔牙中注意避免损伤牙齿的牙周组织，拔牙后马上把前磨牙放入含双抗（青霉素100 U/mL，链霉素100 µg/mL）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS液）中，在超净台内，牙根面的血污使用含双抗的PBS液反复冲洗去除干净，再将根中1/3牙周膜组织用手术刀片轻刮取，用眼科剪将牙周组织剪成1 mm3大小，放置于合成细胞培养基（DMEM）培养液中浸泡。使用6孔板，滴入含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素、200 mL/L的胎牛血清的DMEM培养液在每孔内，在6孔板中的培养液中放入剪好的牙周组织块，每孔放入5～6块。组织块上慢慢盖上灭菌的盖玻片，然后轻轻加压，使盖玻片与组织块之间充盈着培养液，不能有气泡产生，加体积分数为10%的胎牛血清的DMEM 培养液3 mL，放入100%湿度，5% CO2的37℃细胞培养箱中培养，每3天更换培养液一次。第2天在镜下观察有无细菌污染组织块，取细胞培养板时要求轻拿轻放，尽量避免晃动培养板，3天后每天在倒置显微镜下观察细胞游出情况，生长状况和形态特征。当看到组织块周围有细胞密集生长时，可以进行原孔消化。倒掉原培养液，用PBS缓冲液轻轻漂洗培养板两遍，用无菌镊子夹出盖玻片，滴加2.5 g/L的胰蛋白酶，至铺满培养板底。镜下观察，当细胞质回缩变圆，细胞间隙变大时，停止滴加胰酶，再加体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液3 mL。轻轻吹打培养板，使孔板内细胞均匀分布，换培养箱继续培养[5-6]。

1.3 细胞传代培养

传代培养需等到原孔消化，孔板底部表面积80%～90%有细胞生长。

1.4 微波照射分组及方法

当对数期生长到第4代hPDLCs单细胞悬液时，取出10 µL与等体积0.4%台盼蓝混匀，用细胞计数板来计数细胞活力。根据计数结果来制备2.0×104/mL的细胞悬液（含10%胎牛血清DMEM培养液）。为了减少组间差距。每种6个孔，细胞悬液重新混匀后再接种，并且按照“s”型接种。将hPDLCs单细胞悬液随机分组，共分对照组共24孔（仅含胎牛血清FBS的DMEM培养基）：只加培养液而没有细胞，不接受微波照射。高剂量组共24孔（10 µg/mL LPS＋微波辐照40 s）：细胞悬液加入含10 µg/mL的LPS的培养基进行诱导并接受40 s微波照射。中剂量组共24孔（10 µg/mL LPS＋微波辐照20 s）：细胞悬液加入含10 µg/mL的LPS的培养基进行诱导并接受20 s微波照射。低剂量组共24孔（10 µg/mL LPS＋微波辐照10 s）：细胞悬液加入含10 µg/mL的LPS的培养基诱导并接受10 s微波照射。模型组共24孔（10 µg/mL LPS）：细胞悬液加入含10 µg/mL的LPS的培养基进行诱导不接受微波照射。每孔接种100 µL。调整治疗仪的输出模式为治疗模式，调节为14 W的输出功率，辐照后进行细胞培养24 h、48 h后提取培养上清液。

1.5 ELISA法检测IL-6的表达

把上述细胞组条件培养液在常温下溶解。按ELISA试剂说明书，分别在包被了人IL-6单抗的ELISA 120孔板中加入100 µL细胞条件培养液，使用双抗体夹心法检测。待终止反应后，用酶联免疫检测仪Bio-tek检测450 nm的光密度值（D450）。根据ELISA试剂盒中的IL-6标准品D450值曲线，换算出所测定细胞条件培养液中IL-6的水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计量资料数据以表示，采用t 检验和单因素方差分析，两组间差异的显著性检验用 LSD 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

低功率微波对人牙周膜细胞分泌IL-6的影响如表1所示：10 µg/mL LPS刺激hPDLCs的模型组24 h、48 h[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]后IL-6表达均高于对照组[（0.515±0.091）pg/mL，（0.560±0.126）pg/mL]、高剂量组[（0.582±0.090）pg/mL，（0.620±0.117）pg/mL]、中剂量组[（0.760±0.147）pg/mL，（0.730±0.161）pg/mL]，且差异有统计学意义（P＜0.05）；但与低剂量组[（0.835±0.132）pg/mL，（0.845±0.092）pg/mL]比较，辐照时间为10 s时，24 h、48 h后IL-6的表达量与相应模型组[（0.870±0.065）pg/mL，（0.891±0.024）pg/mL]比较差异无统计学意义（P＞0.05），而辐照时间为20 s、40 s时，IL-6表达量均较模型组低（P＜0.05），且随着辐照时间延长，IL-6的表达明显受到抑制，且呈剂量依赖性。

3 讨论

微波热疗是将微波能量集中照射病变部位，被人体组织吸收后，产生微波热效应[7]、生物效应等。通过血流速度和血循环量增加促进血液循环来促进炎症吸收，改善对细胞的营养供给、局部代谢及营养状态，提高组织再生能力，促进局部炎症消退。微波产热快，受热均匀且局限。组织细胞膜通透性增加，局部组织营养、代谢加快，白细胞的吞噬功能增加，机体免疫力增加，促进新陈代谢[8]。另外，微波辐射是一种电磁辐射，微波的非热疗效应可通过电磁场影响组织的分子结构。生物体细胞内外液中含有大量的带电离子，极性和无极性分子在微波电场作用下发生振动和偏转，组织内温度升高，毛细血管扩张，血液灌注量增加。组织细胞的营养供和细胞新陈代谢能力亦显著提高。促进新肉芽的生长，同时对细胞功能和形态恢复的意义也很重大。大量具有免疫功能的相关分子聚集于炎症组织，有效清除代谢产生的影响细胞正常活动的物质，调节局部的酸碱失衡。恢复细胞的微环境，达到消炎、消肿和除痛的疗效。班燕欣等[8]用微波对DIO、OSSTEM、ITI3种类型种植体周围炎进行治疗，有效率达到95%左右，痊愈率达到90%。表明微波治疗对不同种类的种植体周围炎均有效。

病原微生物与局部刺激因素能引起牙周组织直接损伤，宿主持续存在的菌斑微生物的免疫应答所同时造成牙周组织的间接损伤[9]。LPS刺激巨噬细胞、成纤维细胞等之后，细胞合成并分泌IL-1、IL-6、IL-8，前列腺素及肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor，TNF）等多种炎性递质，最终将破坏牙周结缔组织和导致牙槽骨吸收[10]。其中IL-6为多功能的细胞因子，许多活性与牙周炎发病机制都有相关性[10-12]。IL-6等细胞因子具有调控牙周疾病发生发展作用，在宿主反应过程中也至关重要，不但直接导致牙周组织的破坏，而且不断的影响宿主的炎症和免疫反应[13]。黄辉等[14]研究分析二甲双胍对实验性糖尿病牙周炎大鼠炎症因子IL-6表达的影响，结论认为二甲双胍能降低实验性糖尿病牙周炎大鼠IL-6的表达水平。

表1 低功率微波对人牙周膜细胞分泌IL-6 的影响（pg/mL，

注：对照组（仅含FBS 的DMEM 培养基）、高剂量组（10 µg/mL LPS ＋微波辐照40 s）、中剂量组（10 µg/mL LPS ＋微波辐照20s）、低剂量组（10 µg/mL LPS ＋微波辐照10s）、模型组（10 µg/mL LPS）

辐照时间 对照组 模型组 低剂量组（10 s） 中剂量组（20 s） 高剂量组（40 s）辐照24 h 后 0.515±0.091 0.870±0.065 0.835±0.132 0.760±0.147 0.582±0.090辐照48 h 后 0.560±0.126 0.891±0.024 0.845±0.092 0.730±0.161 0.620±0.117

研究表明[15-17]，微波治疗可以降低慢性牙周炎患者龈沟液中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）、天冬氨酸转氨酶及弹性蛋白酶的水平，对牙周炎有确切的治疗作用。本研究通过酶联免疫吸附试验观察微波辐照对LPS作用下HPDLCs中IL-6蛋白表达的影响，发现模型组明显高于对照组及高、中剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。这提示，相对于在LPS作用下IL-6高表达的正常牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，HPDLF），微波辐照显著降低LPS作用下HPDLCs的IL-6表达，并且随辐照剂量的增加，抑制IL-6的作用增强，这可能与微波能抑制炎症状态的牙周膜细胞增殖有一定关系。而低功率微波是否对LPS作用下HPDLCs的凋亡产生影响，从而影响IL-6的分泌，这可能需要更多的进一步研究探讨。

综上，本实验结果认为微波辐照能够显著降低LPS作用下人牙周膜成纤维细胞IL-6的表达，临床上选择14 W低功率微波照射脂多糖诱导的人牙周膜细胞，随辐照剂量的增加，抑制IL-6的作用增强。