猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

高志强，汪 琳，姜 焱，蒲 静，赵相鹏，尹 羿，张 伟

（1. 北京出入境检验检疫局技术中心，北京 100026；2. 江苏出入境检验检疫局技术中心，江苏南京 210001）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是以猪的严重肠炎、呕吐、水样腹泻等消化道症状为特征的高度接触性病毒性传染病。该病病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV），1987年于比利时被首次分离鉴定[1]。PEDV为有囊膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。病毒基因组大小约28 kb，由5'非编码区（5' UTR），3'非编码区域（3'UTR）和至少7个开放阅读框（ORFs）组成。编码蛋白包括4个结构蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白）以及3个非结构蛋白（复制酶1a、1b和ORF3）[1]。PED于1973年在我国首次被发现，目前流行于国内许多种猪场，对养猪业持续造成较为严重的危害[2]。前些年，美国暴发PED并在其国内快速传播，造成新生仔猪死亡率增高，给美国养猪业造成了重大打击[3]。PEDV的快速及时检测，对于预防和控制PED传播和暴发至关重要。目前，检测PEDV的传统方法包括病毒分离、荧光抗体检测、ELISA以及核酸扩增检测等。其中，核酸扩增类检测方法因具有快速、灵敏、特异的优点，已逐渐成为送检样品中PEDV快速检测的首选方法，尤其是RT-PCR和荧光定量RT-PCR，应用最为广泛[4]。

LAMP是一种恒温扩增技术，扩增效率高，不需要特殊仪器，具有快速、特异的优点，而且可以通过在反应前加入指示剂，实现可视化结果判断，对于样品的现场检测非常实用[5]。PEDV M蛋白为一种含量丰富的囊膜蛋白，序列保守特异。因此，本研究采用基于HNB可视化显色的方法，针对PEDV M基因建立了RT-LAMP检测技术，并通过特异性和灵敏度评价，用于送检病死猪样本检测，以期为PEDV现场快速检测提供一种可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸及被检样品 PEDV AQL1和CL株，猪瘟病毒HCLV核酸，伪狂犬病毒Nanyangju，猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro，猪传染性胃肠炎病毒Purdue115，猪链球菌2型C55606核酸：均为本实验室保存；150份粪拭子：猪场送检；37份病死猪脏器样品：北京市顺义区动物卫生监督所送检。

1.1.2 主要试剂 TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（DP315）：购自天根生化科技有限公司；AMV反转录酶、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂：购自Promega公司；Bst DNA聚合酶：购自NEB公司；Ex HS Taq DNA聚合酶、dNTP等：购自TaKaRa公司；羟基萘酚蓝（HNB）：购自Fluka公司。

1.1.3 主要设备 Roche 480荧光PCR仪：Roche公司产品；毛细管电泳仪QIAxcel：QIAGEN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 为确保引物的保守性和特异性，随机选取20株不同地域来源的PEDV M基因序列，使用Vector NTI进行序列比较，结果见图1。根据PEDV M 基因序列，使用在线软件Primer explorer version 4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计1套LAMP引物，并根据序列比对结果，对个别碱基进行简并。设计的引物委托上海生工生物工程有限公司合成，引物名称、序列见表1。

1.2.2 内引物与MgSO4浓度优化 采用25 μL 体系，以5 μL 10-4稀释的病毒RNA为模板，基础体系为1×ThermoPol 缓冲液、16 U Bst DNA聚合酶、5 U AMV 反转录酶、10 U RNA酶抑制剂，betaine 浓度固定为0.8 mol/L，HNB浓度固定为0.12 mmol/L，dNTPs浓度固定为200 nmol/L，外引物量固定为10 pmol。内引物量从40～120 pmol，以20 pmol量递增，MgSO4浓度从1.0～6.0 mmol/L，以0.5 mmol/L递增，筛选最适合MgSO4浓度和最佳内引物量。反应条件为62 ℃ 1 h。

1.2.3 环引物有效性检测 在1.2.2优化体系基础上，分别配制加入和未加入40 pmol环引物LF和BF的反应体系，分别对5 μL 10-3～10-7稀释的病毒RNA模板进行检测，通过反应管颜色变化和毛细管电泳结果确定环引物的有效性，从而确定最终反应体系。反应条件为62 ℃ 1 h。

1.2.4 反应温度优化 为确定最佳反应温度，RT-LAMP 从60～65 ℃ ，以1 ℃进行递增，对5 μL 10-4稀释的病毒RNA 进行检测，以10 min为间隔，观察反应管颜色变化，确定最佳反应温度。

图1 PEDV LAMP引物设计区域的序列比对

表1 PEDV LAMP引物名称和序列

1.2.5 灵敏度试验 应用优化的反应体系，对10倍系列稀释的含105～10-2TCID50/mL的2株PEDV病毒液，分别提取RNA进行检测，并与行业标准[6]规定的荧光RT-PCR方法进行灵敏度比较。

1.2.6 特异性试验 应用建立的反应体系，对猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒HCLV、伪狂犬病毒Nanyangju核酸，猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro、猪传染性胃肠炎病毒Purdue115、猪链球菌2型C55606核酸进行检测，以验证方法的特异性。

1.2.7 重复性试验 对稀释至10、1、0.1 TCID50/mL的0.2 mL 2株PEDV病毒液分别提取RNA，应用建立的RT-LAMP方法进行检测，每个稀释度均进行3次重复，以验证方法的重复性和稳定性。

1.2.8 粪拭子样品和病死猪样品检测 应用建立的方法对150份猪粪拭子样品，以及北京市顺义区动物卫生监督所送检的37份病死猪脏器样品进行检测，同时与荧光RT-PCR检测结果进行比较。

2 结果

2.1 反应体系优化

经多次重复试验确立的最终反应体系包括：5 μL RNA 模 板，1×ThermoPol 缓 冲 液4 mol/L betaine 5 μL，0.1 mol L MgSO40.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，3 mmol/L HNB 1 μL，10 pmol F3 和B3，80 pmol FIP和BIP，LF和BF均为40 pmol，16 U Bst DNA聚合酶，5 U AMV 反转录酶，10 U RNA酶抑制剂。阳性反应管为天蓝色，而阴性反应管为紫罗兰色，显色反应结果与毛细管电泳结果一致。使用环引物，灵敏度可达10-6，而不使用环引物，灵敏度为10-5，检测灵敏度差1个数量级（图2）。

图2 环引物有效性检测结果

2.2 反应温度试验

反应温度试验结果显示，62、63 ℃效果最好，因此选择较高的63 ℃作为最佳反应温度。

2.3 灵敏度试验

对于2株PEDV病毒，应用建立的RT-LAMP反应体系可在1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID50/mL 病毒液中提取的RNA，与荧光RT-PCR方法灵敏度一致，表明方法的灵敏度可以满足要求。图3～图5为PEDV AQL1株和CL株灵敏度检测结果。

2.4 特异性试验

应用建立的检测反应体系，对PEDV、猪瘟病毒HCLV、伪狂犬病毒Nanyangju、猪繁殖与呼吸综合征病毒MLV RespPRRS/Repro、猪传染性胃肠炎病毒Purdue115、猪链球菌2型C55606核酸进行检测，发现建立的检测方法与上述病原核酸均无交叉反应。

2.5 重复性试验

对于2株PEDV病毒，连续3次对稀释至10、1、0.1 TCID50/mL的0.2 mL病毒液提取核酸进行检测。结果显示，2个毒株3个稀释度的病毒核酸3次重复检测均为阳性，表明建立方法的重复性可以满足要求。

2.6 粪拭子和病死猪样品检测

应用建立的方法，对150份猪粪拭子样品和北京市顺义区动物卫生监督所送检的37份病死猪的脏器样品进行了RT-LAMP检测，同时与荧光RT-PCR检测方法进行了比较。结果显示，150粪拭子样品中，检出阳性样品7份，37病死猪样品 中的2份小肠组织为阳性，与荧光RT-PCR检测结果完全一致（图6、图7）。

图3 RT-LAMP 灵敏度试验眼观检测结果

图4 RT-LAMP 灵敏度试验毛细管电泳检测结果

图5 荧光RT-PCR试验的灵敏度试验结果

3 讨论

目前PEDV可能存在于国内大多数种猪场，对养猪业造成较为严重的持续性危害。如果能在现场快速检出样品中的PEDV进而快速采取措施，对于PED防控具有重要实际意义[2]。PEDV 诊断方法包括临床诊断方法和实验室诊断方法。在临床实践中，有经验的兽医可依据临床症状和病理变化做出初步诊断，但确诊需要实验室的一些特异性检测方法。对于PEDV检测，目前常用方法为病毒分离鉴定、荧光抗体、免疫电镜和核酸检测等。病毒分离鉴定周期长，需要数天到数周，不能满足早期诊断的要求；抗原的免疫学检测方法存在灵敏度较差的问题。而核酸检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速、高通量、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，目前已逐渐成为PEDV检测的首选方法，尤其是RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法，目前应用非常广泛。但核酸检测方法需要比较精密的仪器设备，而且还需定期检定，不适用现场检测使用[2]。本研究设计了一套针对8个检测区域的LAMP引物，建立了PEDV RT-LAMP检测技术。灵敏度试验结果显示，可在1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID50/mL病毒液的病毒核酸，与荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致。

图6 阳性样品的RT-LAMP检测结果

图7 阳性样品荧光RT-PCR检测结果

研究表明LAMP由于产物量大，开盖检测很容易发生气溶胶污染，因此许多实验室都采用更严格的分区管理措施和加入指示剂进行闭管检测的方法。本研究使用了0.12 mmol/L HNB作为指示剂实现了闭管检测，阳性反应管呈现天蓝色，而阴性反应管颜色不变，仍为紫罗兰色。此外，为防止污染，还在反应管中加入了20 μL液体石蜡来封闭反应体系，有效防止了检测中的气溶胶污染。在对送检的150份粪拭子检测中，检出阳性样品7份，从37份病死猪样品中，检出2份小肠组织阳性，检测结果与行业标准规定的荧光RT-PCR检测方法检测结果一致，证实了方法的实用性。

4 结论

一系列试验表明，本研究建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异，可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID50/mL的病毒RNA，与实时荧光RTPCR检测方法灵敏度一致，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸均不发生交叉反应。187份粪拭子及病死猪组织样品的应用检测结果显示，该方法与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致，表明建立的方法适用于送检样品的PEDV现场快速检测。