龙葵单体澳洲茄边碱对大肠癌HCT116细胞增殖和凋亡作用

胡兵，安红梅，闫霞，郑佳露，黄晓伟，李淼

(1.上海中医药大学附属龙华医院 中医肿瘤研究所 肿瘤科，上海 200032；2.上海中医药大学附属龙华医院 科技处，上海 200032)

龙葵是茄科茄属植物龙葵SolanumnigrumL.的全草，性寒味苦，有小毒，具有清热解毒、利水消肿功效，可以用于感冒、牙痛、慢性支气管炎、泌尿系感染等炎性疾病的治疗，现广泛用于各种肿瘤的治疗。龙葵可以抑制肿瘤细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡和自噬，增强化疗作用，抑制上皮-间质转化、肿瘤转移和血管生成，并可改善免疫功能[1-2]。龙葵含有糖苷生物碱、糖蛋白、多糖以及多酚等成分，澳洲茄边碱是其中的糖苷生物碱之一[3]。本研究观察了澳洲茄边碱对大肠癌HCT116细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂

人大肠癌细胞株HCT116购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM培养基购自美国Corning公司。胎牛血清购自澳大利亚Ausbian公司。澳洲茄边碱购自美国APExBIO公司。CCK-8(Cell Counting Kit-8)为美国Sigma公司产品。细胞凋亡检测试剂盒为美国eBioscience公司产品。Casapse-3活性检测试剂盒为美国Promega公司产品。

1.2 细胞增殖检测

5×103对数生长期HCT116细胞接种于96孔板，接种后第2天加入不同浓度澳洲茄边碱或等体积DMSO，每组3个复孔；药物作用24 h、48 h和72 h后加入10 μL CCK-8，37 ℃反应4 h，酶标仪450 nm波长检测各孔OD值，按公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值。

1.3 克隆形成实验

1×103对数生长期HCT116细胞接种于6孔板，接种后第2天加入不同澳洲茄边碱或等体积DMSO，每组3个复孔，每3天换液1次；9 d后4%多聚甲醛固定细胞，Giemsa染色，计数克隆数，计算克隆形成抑制率：克隆形成抑制率=[(对照组克隆数-实验组克隆数)/对照组克隆数]×100%。

1.4 细胞凋亡检测

5×105对数生长期HCT116细胞接种于6孔板，接种后第2天加入不同澳洲茄边碱或等体积DMSO，每组3个复孔；药物作用48 h后收集细胞，按试剂盒说明书Annexin V-APC/PI标记细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5 Caspase-3活性检测

1×104对数生长期HCT116细胞接种96孔板，接种后第2天加入不同澳洲茄边碱或等体积DMSO，每组3个复孔；药物作用48 h后，参考试剂盒说明书检测Caspase-3活性，结果以对照组倍数表示。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 澳洲茄边碱对HCT116细胞增殖作用

采用CCK-8法检测澳洲茄边碱对HCT116细胞增殖的作用，结果显示，4～32 μmol/L澳洲茄边碱作用48 h可以抑制HCT116细胞增殖(表1)。研究进一步选取3个剂量，观察了澳洲茄边碱不同作用时间对HCT116细胞增殖的影响，结果显示，6～10 μmol/L澳洲茄边碱可以抑制HCT116细胞增殖，呈剂量与时间依赖性(见图1)(P<0.01)。

表1 澳洲茄边碱对HCT116细胞增殖作用

注：与对照组比较，**P<0.01

图1 澳洲茄边碱不同作用时间对HCT116细胞增殖影响

2.2 澳洲茄边碱对HCT116细胞克隆形成作用

采用平板法检测HCT116细胞克隆形成，结果显示，澳洲茄边碱可以抑制HCT116细胞克隆形成，与对照组比较差异显著(表2)(P<0.01)。

表2 澳洲茄边碱对HCT116细胞克隆形成作用

注：与对照组比较，**P<0.01

2.3 澳洲茄边碱对HCT116细胞凋亡作用

采用Annexin V-APC/PI双色荧光标记，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示澳洲茄边碱可以促HCT116细胞凋亡，与对照组比较差异显著(表3)(P<0.01)。

表3 澳洲茄边碱对HCT116细胞凋亡作用

注：与对照组比较，**P<0.01

2.4 澳洲茄边碱对HCT116细胞Caspase-3活性影响

采用试剂盒检测澳洲茄边碱对HCT116细胞Caspase-3活性影响，结果显示澳洲茄边碱可以显著增强HCT116细胞Caspase-3活性(见表4)(P<0.01)。

表4 澳洲茄边碱对HCT116细胞Caspase-3活性影响

注：与对照组比较，**P<0.01

3 讨论

大肠癌是全球最常见恶性肿瘤之一，在全球男性肿瘤发病率居第三位，在全球女性中居第二位；在我国，大肠癌的发病率呈上升趋势，在男性和女性肿瘤发病中居第五和第四位[4-5]。中医药在大肠癌的治疗中发挥了重要的作用[6-7]；龙葵是大肠癌临床最常用的抗癌中药之一，在大肠癌细胞中具有广泛的抗癌作用；澳洲茄边碱(Solamargine)是龙葵的主要成分之一[1-3]。

肿瘤细胞用于基因表达或功能的异常，呈现失控增殖，增殖异常是肿瘤细胞的基本特征之一；抑制细胞增殖和或阻滞细胞增殖周期是药物治疗肿瘤的重要策略。本研究首先观察了澳洲茄边碱对HCT116细胞增殖的作用，结果显示，澳洲茄边碱可以抑制HCT116细胞增殖，呈剂量与时间依赖性；澳洲茄边碱长时间作用可抑制HCT116细胞克隆形成；提示澳洲茄边碱对HCT116细胞有较好的抗癌作用。

细胞凋亡是相关信号作用下，细胞在内在蛋白调控下的自主性细胞死亡，可以呈现凋亡小体、DNA断裂等特征变化[8]。Annexin V/PI标记是细胞凋亡的经典检测方法。在正常细胞中，磷酯酰丝氨酸位于细胞膜内侧；在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面；Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，可与凋亡细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合，通过Annexin V偶联的荧光素可检测早期细胞凋亡。中晚期凋亡细胞的细胞膜完整性破坏，PI可以进入细胞与DNA结合呈现红色荧光，从而可检测中晚期凋亡。本研究采用，Annexin V/PI标记流式细胞仪检测显示，澳洲茄边碱可激发HCT116细胞凋亡。

细胞凋亡受多个蛋白的调控，目前研究显示细胞凋亡主要有外源通路(死亡受体通路)、内源通路(线粒体通路)和内质网通路；肿瘤治疗研究较多的是外源通路和内源通路。在外源通路中，死亡配体如TNFα、FasL与对应受体结合，相继激活Caspase-8和3，启动细胞凋亡；在内源通路中，凋亡相关信号促使线粒体释放细胞色素C，继而活化Caspase-9和3，激发细胞凋亡；Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶[9-10]。本研究结果显示，澳洲茄边碱作用后，HCT116细胞Caspase-3活性增强，提示Caspase-3参与澳洲茄边碱对HCT116细胞凋亡的作用。

综上所述，本研究结果显示澳洲茄边碱可以抑制HCT116细胞增殖和克隆形成，促HCT116细胞凋亡，其作用机制可能与活化Capase-3相关，值得进一步研究。