小球藻不同接种密度对铜绿微囊藻生长抑制的研究

朱为菊

摘 要：以同周期单独培养的微囊藻生长密度为对照，将小球藻在低密度、中密度和高密度条件下，分别与低密度的铜绿微囊藻共同培养，探究对其生长抑制作用。结果表明：（1）小球藻的初始密度不同，对其的生长具有显著影响（p<0.01，F=5.75），随着初始接种密度的增加，最大生物量、生长速率均存在差异。当2种微囊藻的初始接种密度为4.5×105个/mL单独培养条件下，铜绿微囊藻的生长速率高于小球藻的，但是其藻类最大现存量却低于小球藻的。（2）在共培养条件下，当铜绿微囊藻密度不变，随着小球藻接种密度的提高，对微囊藻生长的影响效果愈加明显，尤其是当小球藻密度提高至9×105个/mL以上时。

关键词：铜绿微囊藻;接种密度;竞争抑制参数;藻类水华防治

中图分类号 X52文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）24-0137-04

Abstract：In this paper，comparing with the concentration of microalgae individually cultivated in the same period，we investigated the growth of different initial cell density of Chlorella sp.，as well as the concentrations of them affecting the growth of Microcystis aeruginosa by a mixed culture method. The results showed that the growth of the initial cell density of Chlorella sp. had a significant difference（p<0.01，F=5.75），and the differences of maximum biomass and growth rate were obvious with the promotion of the initial cell density of Chlorella. When the initial cell density of Chlorella sp. and M. aeruginosa were 4.5×105cells/ml in single cultivation period，the growth rate of M. aeruginosa is higher than of Chlorella.，but the maximum cell density of M. aeruginosa is lower than of Chlorella. The Chlorella can inhibit the growth the M. aeruginosa，and the inhibition was more obvious with the promotion of the initial cell density of Chlorella，especially the cell density reached the 9×105 cells/mL.

Key words：Microcystis aeruginosa;Initial cell density;Competitive inhibition parameters;Control of the algal bloom

藻类水华是全球性的水生态灾害，由于微囊藻水华出现频率较高且危害严重，日益引起了国内外学者的广泛关注[1-2]，开展了大量的野外跟踪调查和室内模拟研究以揭示蓝藻水华的暴发机制，并采取了相应的防控措施[3]。研究表明，微囊藻独特的生物学特性（具有伪空胞、对磷吸收利用能力强等）[4-6]，使其在高温、低光的环境条件下具有较强的竞争优势[7]。在绿藻与铜绿微囊藻共培養的体系中，随着温度的升高，混合培养体系中微囊藻的优势地位逐渐明显[8]。在硅藻与铜绿微囊藻的共培养体系中，当Si∶P<100时，微囊藻占优势[9]。在铜绿微囊藻与小球藻的共培养体系中，高营养水平下的铜绿微囊藻在竞争中占优势，低营养水平时小球藻具有竞争优势;而在同一营养水平条件下，氮是铜绿微囊藻竞争优势的先决因子，而小球藻是磷[10]。对于藻华的防治，多数研究集中在调控水体的环境条抑制水华的发生，而关于藻类不同起始密度对水华蓝藻生长抑制的影响研究则相对较少[11]。为此，本研究以铜绿微囊藻和从海南省当地水体中分离的1株小球藻为实验材料，探究小球藻不同接种起始密度对铜绿微囊藻生长的抑制作用，旨在阐明小球藻与铜绿微囊藻之间的竞争关系，同时为藻类水华生物防治提供一定的基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 藻种来源 实验所用的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB-315;小球藻取自海南省内淡水水体，经分离纯化;2个藻株均用BG11培养基经实验室内扩大培养用于实验[12]。

1.2 实验设计 本实验设置3个小球藻密度梯度，分别为低密度组（4.5×105个/mL）、中密度组（9×105个/mL）、高密度组（18×105个/mL），并与浓度为4.5×105个/mL铜绿微囊藻进行共同培养实验。以单独培养藻株作为对照实验。每组设3次重复。

1.3 培养方法 培养液采用BG11培养基，取指数生长期的藻液接种至灭菌的含有50mL培养液的100mL三角锥形瓶中，置于恒温光照摇床中震荡培养，培养条件为：25℃、230r/min、24h全光照、光照强度3000lx。

1.4 数据统计

1.4.1 细胞密度 自接种次日起为第1天，在上午10：00每隔48h在无菌条件下取样，利用血球计数板进行细胞计数。每个样品计数3次，取其平均值。

1.4.2 比生长速率 根据藻液细胞密度计算比生长速率[13]。计算公式如下：

式中：μn为第n天的比生长速率;Nn为第n天的细胞密度（cells·mL-1）;Nn-1为第n-1天的细胞密度（cells·mL-1）;tn为对应于Nn的培养天数;tn-1为对应于Nn-1的培养天数。同时，将藻类从试验开始至生物量达最大现存量这一时间段内的比生长速率的平均值定义为藻类的平均比生长速率（μ），用于比较藻类生长速率的大小。

1.4.3 抑制率 对藻类共同培养的竞争结果采用抑制率（促进率）表示[14-15]。计算公式如下：

抑制率（%）=（共同培养的最大现存量一同期单独培养的现存量）/同期单独培养的现存量×100 （2）

正值表示促进作用，负值表示抑制作用。

2 结果与分析

2.1 低密度条件下小球藻和微囊藻的生长情况 在单独培养的条件下，微囊藻和小球藻在接种第3天均进入快速生长时期。微囊藻在培养第9天达到最高值为1.43×107个/mL，小球藻第13天密度达到最高值为2.51×107个/mL（图1）。当2种藻类共同培养时，小球藻在接种后第3天密度达到3.95×106个/mL，为单独培养时的16%，第3天后小球藻的生长被微囊藻所抑制（图2）。而微囊藻在接种后第17天密度达到1.88×107个/mL，与单独培养时密度值接近（图2）。在共同培养条件下，微囊藻的平均比增长速率低于单独培养条件下，而小球藻的平均比增长速率高于单独培养条件下的（表1）。

2.2 中密度条件下小球藻和微囊藻的生长情况 当小球藻接种密度为9×105个/mL时，其生长曲线呈现波折式，在接种第9天达到最大现存量，为1.35×107个/mL（图3）。当小球藻接种密度为9×105个/mL与微囊藻接种密度为4.5×105个/mL共同培养时，小球藻能抑制微囊藻生长，抑制时间为7d（图4）。小球藻密度在培养第7天达到最高为5.73×106个/mL，为单独培养时密度最高值的42%，微囊藻在培养第11天，密度达到最高为8.38×106个/mL，为单独培养时密度最高值的58%。在共同培养条件下，微囊藻和小球藻的平均比增长速率均低于单独培养条件下的（表1）。

2.3 高密度条件下小球藻和微囊藻的生长情况 当小球藻接种密度为18×105个/mL时，其生长曲线呈现波折式，在接种第7天达到最大现存量，为1.73×107个/mL（图5）。当小球藻接种密度为18×105个/mL与微囊藻接种密度为4.5×105个/mL共同培养时，小球藻能抑制微囊藻的生长，抑制时间为14d（图4）。小球藻的密度在培养第9天达到最高为9.03×106个/mL，为单独培养时密度最高值的52%，微囊藻在培养第17天，密度达到最高为7.77×106个/mL，为单独培养时密度最高值的54%。在共同培养条件下，微囊藻和小球藻的平均比增长速率均低于单独培养条件下的（表1）。

2.4 小球藻和微囊藻共培养条件下的相互作用 从表2可以看出，在低密度共同培养条件下，小球藻和微囊藻之间表现为相互促进的作用，其中小球藻对微囊藻的促进作用更为明显。在中密度共同培养条件下，小球藻对微囊藻的生长有抑制作用，但是抑制较弱;微囊藻对小球藻的生长有促进作用。在高密度条件下，小球藻和微囊藻之间表现为相互抑制的作用，其中小球藻对微囊藻的抑制作用更为明显。

3 讨论

3.1 铜绿微囊藻和小球藻的生长 从低密度条件下2种藻类的单独培养来看，铜绿微囊藻的生长速率高于小球藻的，但是其藻类最大现存量却低于小球藻的。这主要是由于铜绿微囊藻在培养第9天细胞密度达到最高，而小球藻在培养第11天细胞密度达到最高，导致生长速率低于微囊藻的。张晓玥[16]对铜绿微囊藻和小球藻的研究发现，铜绿微囊藻的生长速率高于小球藻的，细胞密度最大值为1.41×107个/mL，与本研究铜绿微囊藻的最大现存量相当，小球藻的细胞密度最大值为8.12×106个/mL，比本研究小球藻的最大现存量低，这说明小球藻具有较长的生长期。小球藻的初始密度不同对其生长有显著影响（p<0.01，F=5.75）。随着初始接种密度的增加，最大生物量、生長速率都存在差异。蔡恒江[14]研究发现，随着接种密度的增加，赤潮异弯藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻进入指数生长期和静止期的时间都相应的提前，且3种藻细胞最大细胞密度均相应地降低。张坤等[17]研究表明，当微囊藻的初始接种密度不同时，铜绿微囊藻的最大生物量、生长速率以及拐点时间都存在差异。这说明，在微藻生长过程中，微藻起始密度对其生物量和种群密度有着很大的影响，进而影响其对资源的竞争和生物抑制作用的发挥。

3.2 小球藻与铜绿微囊藻的种间竞争 种间竞争主要表现在对营养盐、光照等资源的竞争及分泌克生物质而抑制对方[18-19]。当小球藻与铜绿微囊藻在起始密度相同的共培养条件下，铜绿微囊藻以其较小的比表面积[4]，能较快的获取生长所需的营养盐、光照，具有较强的竞争优势。铜绿微囊藻是水华蓝藻的常见种类之一，由于其对外界磷的吸收、利用能力强，在水体中容易获得优势地位[5]。钱善勤[20]研究发现，铜绿微囊藻对可溶性有机磷的利用能力强于蛋白核小球藻的，这可能是导致其富营养化水体中形成优势种的原因之一。陈德辉等[21]研究表明，微囊藻对栅藻的抑制能力是栅藻对微囊藻抑制能力的7倍，并以此作为微囊藻可能爆发成为“水华”的理由之一。也有研究认为，微囊藻能够分泌毒素对其他藻类产生他感作用而抑制对方的生长。许秋瑾等[22]研究表明，微囊藻毒素对栅藻的生长具有显著的抑制作用，而且微囊藻在与栅藻混合培养时比纯培养时能产生更多的毒素。Fogg等[23]研究发现，藻类在生长发育过程中会不断向周围环境释放多种物质，如碳水化合物、酶、脂类、毒素以及抑制和促进因子等来影响水体中其他藻类的生长发育。谭啸等研究表明，在四尾栅藻和铜绿微囊藻共培养的体系中，当温度从22℃升高到30℃，优势种从四尾栅藻转变为铜绿微囊藻[8]。蓝藻和绿藻吸收水体中CO2的能力是不同的[24]。Shapiro[25]等综合前人及本人的实验结果，提出了蓝藻形成优势的高pH/低CO2理论。

随着小球藻起始密度的增加对微囊藻的生长影响效果愈明显，可以通过提高小球藻的密度至9×105个/mL以上，来控制密度为4.5×105个/mL微囊藻的生长。蔡恒江等[14]研究发现，随着赤潮异弯藻初始接种密度的增高，该种类对中肋骨条藻的生长的抑制作用也更加明显。陈家长等[26]研究发现，可以通过条件水体pH值以及普通小球藻的浓度来控制鱼腥藻的生长。Piazzi等[27]研究了2种微藻种内和种间竞争，发现在细胞密度较低情况下，2种微藻的竞争现象不明显，但随着培养时间的增加，细胞密度变大，微藻间的抑制作用变得明显，培养后期微藻间出现竞争，可能是因为空间和营养资源的缺乏。本研究发现，可能由于水体中资源和空间受到限制，导致2种微藻的最大生物量相对于单培养试验数值降低。蓝藻水华的暴发通常是单一物种占优势[2]，因此，为了减少水华的暴发几率，可以通过提高共生有益藻类的竞争优势，来降低水华藻类的生物量以及抑制其在生长的各个阶段的竞争优势。

4 结论

（1）小球藻初始密度的不同，对其生长具有显著的影响（p<0.01，F=5.75）。随着初始接种密度的增加，最大生物量、生长速率均存在一定的差异。

（2）在2种藻类共同培养的条件下，随着小球藻起始密度的增加，对微囊藻生长的影响效果愈加明显。当小球藻的密度提高至9×105个/mL以上，可以控制密度为4.5×105个/mL微囊藻的生长。

（3）通过提高共生有益藻类的竞争优势，可以降低水华藻类的生物量以及抑制其在生长的各个阶段的竞争优势，实现藻类水华的生物防治。

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（责编：张宏民）