不同氮源和环境因子对花津滩芽孢杆菌SLWX2脱氮性能的影响*

王 越 成 钰 李秋芬 张 艳

(1.上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；2.农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)

城镇生活污水、工业废水、农业肥料污染等带来的环境中过多的N会对水生生物产生危害(姜爱霞,2000)。生物脱氮技术因可以弥补物理化学法的缺点，成本低、效率高、操作简单且不会对环境造成二次污染(梁刘艳等, 2001)而受到重视。传统生物脱氮技术具有硝化菌与反硝化菌对环境的要求不同、硝化菌生长缓慢且反硝化过程消耗有机氮源导致反应速率减缓等缺点(程海华等, 2016)。随着生物脱氮理论与技术的发展，越来越多的异养硝化-好氧反硝化菌(Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)被发现和研究，这类菌株在生物脱氮过程中具有同时去除C和N、硝化与反硝化同时进行、无二次污染、节约反应系统面积与成本等独特优势(Renet al, 2014； 孙雪梅等, 2012； 乔森等, 2014； 苏婉昀等, 2013)。因而，HN-AD的研究逐步成为生物脱氮研究领域的一大热点。目前，我国对这类菌株的研究尚处于起步阶段，主要集中于菌株筛选和脱氮特性研究(刘晶晶等, 2008； Wanget al, 2009； 黄钧等, 2009；Yaoet al, 2013)，对其脱氮条件和机理的报道较少。本实验室从刺参(Apostichopus japonicus)养殖环境中分离得到1株HN-AD菌，经鉴定为花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)，命名为 SLWX2(成钰等,2016)。Chen 等(2011)、Kaçar 等(2013)和 Phelan 等(2013)也分别在海胆(Echinoidea)、爱琴海东部海岸和海绵(Phylum porifera)中检测到花津滩芽孢杆菌，但并未见对其脱氮性能的研究报道。环境因素对微生物脱氮性能的发挥具有重要意义，目前，已有许多研究表明，不同氮源、pH、溶解氧、温度对不同脱氮生物的脱氮效率有明显影响(刘国玉等, 2003； 刘芳,2014)。本实验室已研究了SLWX2在多种氮源同时存在情况下的脱氮特性及其对不同浓度无机氮的耐受范围(成钰等, 2016)。本研究报道不同氮源和不同环境因子对该菌株生长及脱氮效果的影响，探究其最佳脱氮条件，以期为菌株 SLWX2在生物脱氮工程中的使用提供理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本实验室由刺参养殖环境中分离得到 1株花津滩芽孢杆菌，命名为SLWX2。

1.2 培养基

培养基中的葡萄糖过滤灭菌后，按比例加入到已灭菌的其他成分中。上述药品均为分析纯，采购自国药集团。

1.3 不同氮源对菌株脱氮特性的影响

将活化后处于对数生长期的 SLWX2菌液，接入分别以(NH4)2SO4、NaNO2和 KNO3为唯一氮源的培养基，使菌液终浓度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范围内，每种3个平行，于28℃、150 r/min震荡培养42 h。每6 h取样检测OD600值及-N、-N、-N和总氮(TN)的浓度。

1.4 不同环境因素对菌株生长和脱氮的影响

将对数生长期的SLWX2菌液接种在-N培养基内，保证菌液终浓度在(1.8～1.9)×106CFU/ml范围内，每组3个平行。培养基根据硝化培养基进行调整，-N初始浓度约为50 mg/L，在实验条件中，温度为28℃、盐度为30、pH为7、C/N为10的基础上，控制单因素变量，各实验组单因素设定如下：

(1) 温度：20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、50℃；

(2) pH：5、6、7、8、8.5、9；

(3) C/N：1、5、10、15、20、30、40；

(4) 盐度：0、5、10、20、25、30、50、80

150 r/min震荡培养24 h后，取样测OD600值，离心，取上清液，测-N值。

1.5 无机氮和总氮的测定方法

参照《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007)，-N的测定采用次溴酸盐氧化法；-N的测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法；-N的测定采用锌-镉还原法。TN测定采用总有机碳(Total organic carbon, TOC)分析仪(TOC-VCPH, TNM-1)，按照仪器使用说明书进行操作。

2 结果

2.1 不同氮源对菌株脱氮特性的影响

2.1.1 硫酸铵为唯一氮源时菌株的脱氮特性 在(NH4)2SO4为唯一氮源的-N培养基(添加葡萄糖)中连续培养菌株SLWX242 h。开始培养的24 h中，菌体生长迅速，OD600值达到 0.45，无明显延迟期，-N和TN质量浓度由初始的54.28、54.63 mg/L分别降低至36.00、38.52 mg/L；培养30 h后，菌体OD600值增长为0.83，-N和TN质量浓度迅速下降，去除率分别为82.50%和78.30%；之后菌体增殖稍缓慢，培养36 h后，-N和TN基本被去除完全，去除率分别达 96.4%和 93.7% (图 1)。综上可知，-N和TN的去除主要发生在SLWX2菌株的对数增长期(0～30 h)，表明以-N为唯一氮源时，菌株SLWX2可快速生长和脱氮，几乎没有延迟期，30 h内，可去除80%以上的-N，在菌株SLWX2的生长过程中，未检测到-N和-N。

图1 氨氮培养基中各指标的动态变化Fig.1 Dynamic changes of each index in the ammonia culture medium

2.1.2 亚硝酸钠为唯一氮源时菌株的脱氮特性

在NaNO2为唯一氮源的培养基(添加葡萄糖)中，连续培养SLWX2菌株42 h。开始培养的30 h内，菌体生长缓慢，-N和TN质量浓度下降幅度不明显，即菌株SLWX2对-N的适应期较长；培养至30 h时，SLWX2菌株进入对数生长期，-N和TN质量浓度开始有明显的下降；培养 42 h后，OD600值达1.38，-N和TN去除率分别为99.9%和92.5%(图2)。综上可知，-N和TN的快速去除发生在30～42 h的对数生长期，即在 NaNO2为唯一氮源时，菌株SLWX2的生长和脱氮会延迟，去除-N主要在24 h以后，但对NaNO2的去除很彻底。

图2 亚硝酸盐氮培养基中各指标的动态变化Fig.2 Dynamic changes of each index in the nitrite nitrogen medium

在SLWX2菌株的生长过程中，-N和-N的质量浓度基于初始值小幅度波动，没有明显积累，表明-N去除过程中，不产生-N和-H。

2.1.3 硝酸钾为唯一氮源时菌株的脱氮特性 在KNO3为唯一氮源的培养基(添加葡萄糖)中，连续培养SLWX2菌株48 h，开始培养的30 h内，菌体生长缓慢，-N和 TN质量浓度基本无变化，即菌株SLWX2对 KNO3具有较长适应期；培养至 30 h时，SLWX2菌株进入增殖迅速的对数生长期，-N和TN质量浓度呈直线下降，出现-N的积累；培养42 h时，OD600值达0.98，-N和TN去除率分别为65.0%和46.6%，-N为14.69 mg/L，为最大累积量；随后的6 h中，-N和TN持续下降，-N开始降低，到48 h时，-N和TN去除率分别达78.1%和75.7%，-N质量浓度也降至0.051 mg/L(图3)。综上可知，-N和 TN的大量去除发生在菌株SLWX2的对数生长后期，即培养30 h之后。说明菌株SLWX2以-N为唯一氮源是，脱氮会发生延迟，主要发生在对数增长期的中后期，且脱氮效率较-N和-N稍低。

在菌株SLWX2整个脱氮过程中，检测到NaNO2质量浓度呈先上升后下降趋势，有少量前期积累，但检测不到-N，说明-N去除过程中产生-N，但不产生-N。

图3 硝酸盐氮培养基中各指标的动态变化Fig.3 Dynamic changes of each index in the nitrate nitrogen medium

2.2 不同环境因素对菌株生长和脱氮的影响

2.2.1 温度对菌株SLWX2生长和氨氮去除的影响

温度对菌株 SLWX2的生长和脱氮能力影响较大。在 20℃条件下，菌体生长缓慢，浓度保持在很低的水平，且对-N的去除效果不明显；在25℃、28℃条件下，菌株SLWX2菌体浓度和-N去除率较20℃时有所增加。在30～40℃的培养范围内，菌体均生长良好，且能高效脱氮，对应 OD600值分别为 1.200、0.931和0.764，-N去除率分别达99.8%、99.4%和84.7%。但在50℃培养条件下，菌体停止生长，OD600值仅为0.0191(图4)。综上可见，菌株SLWX2生长的适宜温度为 28～40℃，并能实现较高的-N去除率，其中，最适菌体生长及脱氮温度为30℃。

图4 不同温度对菌株SLWX2生长和脱氮的影响Fig.4 Effect of temperature on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.2 pH对菌株SLWX2生长和氨氮去除的影响

菌株SLWX2在不同的pH条件下，培养24 h后测得的生长和-N去除情况见图5。从图5可以看出，菌株SLWX2能在pH为6～8.5范围内，较好生长且维持较高的-N去除率，相应OD600值为0.249、0.261、0.464和0.364，去除率分别为49.9%、49.8%、59.6%和 55.8%。太偏酸性(pH为5)或碱性(pH为 9)的条件均不利于菌体生长和-N的去除，菌体OD600值仅为 0.0124和 0.131，-N去除率低至25.3%和23.2%(图5)。综上可见，弱酸、中性和弱碱(pH 为 6～8.5)条件下，菌株 SLWX2均能生长，其对pH具有较宽的适应范围，中性偏碱的条件更利于其生长及脱氮，最适pH为8.0。

图5 不同pH对菌株SLWX2生长和脱氮的影响Fig.5 Effect of pH on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.3 C/N对菌株SLWX2生长和氨氮去除的影响

菌株SLWX2在C/N为1时，OD600值仅为0.129，生长缓慢，且-N去除率仅为8.7%。随着C/N的增大至25时，菌体生长速度与-N去除率逐渐提高。C/N为5～25时，菌体生长OD600值分别为0.235、0.248、0.264、0.291和0.463，对应的-N去除率分别达16.0%、18.2%、23.1%、36.9%和45.7%。C/N为20～25时，菌体生长与-N去除效果最佳，但在C/N继续增大时，菌体生长受到限制，OD600值明显下降，对应的-N去除率也降至10.0%和4.3%(图6)。综上可见，菌株SLWX2生长及脱氮的最适C/N为25。

图6 不同C/N对菌株SLWX2生长和脱氮的影响Fig.6 Effect of C/N on the growth and nitrogen removal of SLWX2

2.2.4 盐度对菌株SLWX2生长和氨氮去除率的影响

从图 7可以看出，菌株 SLWX2在 NaCl为 0～25 g/L培养条件下，具有良好的生长和脱氮性能，OD600值分别为 0.830、0.926、0.979、1.01和1.08，-N去除率均在90%以上，分别达99.4%、99.8%、96.2%、97.0%和 100%。菌体生长随着 NaCl浓度的增加而受到限制，在NaCl为30 g/L时，-N去除率降至24.0%(图7)。综上可见，盐度对菌株SLWX2的生长和-N去除有较大影响，淡水至低盐度有利于菌体的生长和脱氮，生长及脱氮的最适盐度为25，盐度高于30则不利。

图7 不同盐度对菌株SLWX2生长和脱氮的影响Fig.7 Effect of salinity on the growth and nitrogen removal of SLWX2

3 讨论

3.1 不同氮源对菌株脱氮性能的影响

生物脱氮可以发生在菌体生长的任何一个时期，因菌种而异。张光亚等(2003)研究表明，硝化作用主要发生在老龄细胞；辛玉峰等(2011)和黄廷林等(2015)分离得到的菌株不动杆菌(Acinetobactersp.) YF14和皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii) A14，其硝化和反硝化均发生在菌体生长的稳定期；郭强等(2015)研究表明，地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)的硝化过程发生在对数期和稳定期。本研究发现，菌株SLWX2脱氮主要发生在菌体对数生长期，与王弘宇等(2009)、刘天琪等(2015)的结论一致。不同氮源条件下，菌株SLWX2进入对数增长期的时间不同，-N为氮源时，几乎没有延迟期，0～30 h为对数增长期，而-N和-N分别为氮源时，延迟期较长(0～30 h)，30～48 h才为对数增长期，与已报道的好氧反硝化比异养硝化更快进入对数增长期(蒋静艳等, 2009)这一结论不同，可能是因为2个相关酶系的激活顺序不同，或者NaNO2在溶液产生游离亚硝酸(FNA)，对菌株生长和代谢产生抑制作用(Zenget al, 2008)，又或者是菌株对-N和-N的耐受性较差。

3.2 环境因子对菌株生长和脱氮性能的影响

芽孢杆菌在微生物处理含 N废水中有巨大的研究和应用价值，而1株有应用价值的脱氮菌株，也需要有较为宽泛的环境适应性(李秋芬等, 2013)。本研究探究不同环境因素(温度、pH、C/N、盐度)对菌株SLWX2的生长和脱氮能力的影响，发现不同的温度、pH、C/N和盐度对该菌株的生长和脱氮均有明显的影响，但该菌株对环境的适应范围较宽，在温度为28～40℃、pH为6～8.5、C/N 为 5～25、盐度为 5～30的范围内，均能较好地生长，并维持较高的脱氮能力，而且菌体生长越好，脱氮效果越好，说明菌体生长和脱氮基本是同步进行的，这与王娟等(2010)的研究结果一致。

多数报道的芽孢杆菌生长和脱氮性能研究均在30℃条件下进行，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WZX-8的最大-N去除率发生在 30℃培养下(廖小红等, 2009)，气单胞菌(Aeromonassp.) HN-02的最佳-N去除温度也为30℃(陈茂霞等, 2013)，这与本研究的菌株 SLWX2的最适生长和脱氮温度相同。研究还发现，菌株SLWX2在40℃条件下,仍能良好生长和脱氮，-N去除率达84.7%，与其他这类菌株(梁贤等, 2015； 陈茂霞等, 2013； 李秋芬等, 2013)相比，具有耐高温的优势。温度为 20℃以下和 50℃以上时，菌体基本不生长，脱氮效果不佳，这是因为低温使得酶活性受到抑制，而高温条件下，酶易失活，从而影响脱氮效果。

环境中pH与微生物的生命活动密切相关，是影响微生物活性的重要指标之一。苏俊峰等(2012)研究表明，环境中H+浓度不能超过微生物酶的适应范围，否则影响酶活性，影响微生物对营养物质的吸收。菌株SLWX2的最适脱氮pH范围为6～8.5，与陈茂霞等(2013)研究的pH为6～9相似。而海水养殖水体的pH一般是中性或偏碱性，所以该菌株可以在实际养殖废水处理中应用。

异养菌通常需要有机物作为氮源和能源，有机碳不足时，不利于菌体生长，相应的生理功能也会降低，因此，HN-AD菌对C/N的要求较高(鲜思淑等, 2016)。本研究通过固定 N添加量和调整葡萄糖的质量浓度控制C/N时发现，在C/N为5～25范围内，-N去除率随C/N增加而增大，但C/N高于30时，-N去除率开始下降，这种先上升后下降的趋势与孙庆花等(2016)、李秋芬等(2013)研究结果相似。因为氮源远高于菌体的生长所需量时，氮源成为非限制因素(王弘宇等, 2007)，过多的氮源会嵌入酶结构导致酶活性降低，硝化能力也随之下降(宋宇杰等, 2013)。不同菌株的最佳脱氮C/N并不相同，菌株X3的最佳C/N为5时(李秋芬等, 2013)，雷氏普威登斯菌(Providencia rettgeri) YL(席星林等, 2014)的最佳脱氮效果发生在C/N为 10时，假单胞菌 XS76(吴建江等, 2013)去除-N的最适C/N为15，本研究的菌株SLWX2对氮源的要求较高，最佳C/N为25，但实际含N废水中的C/N较低，若增加氮源便导致脱氮成本增加，因此，还需要针对低C/N，对该菌进行驯化，以提高脱氮效率。

微生物可以通过渗透压调节自身新陈代谢，因而对盐度有一定的适应能力(张彦灼等, 2015)，但盐度过高，会引起渗透压升高而抑制代谢活动，降低微生物活性，严重时可导致细胞脱水发生质壁分离，甚至死亡(鲜思淑等, 2016)。多数芽孢杆菌的脱氮特性研究都是在低盐条件下进行的，而本研究的菌株SLWX2是从海水中分离得到，具有较好的耐盐性，NaCl为2.5%时，菌株生长和脱氮效果最佳，-N去除率达100%，NaCl为3%时，菌体仍能生长，也有一定的脱氮效果。值得关注的是该菌株在NaCl为0条件下仍生长良好，-N去除率达90%以上，这与同样分离于海水的菌株X31 (马放等, 2005)在无盐条件下不能生长的特性相比，有明显优势。综上所述，该菌株在淡水或低盐度含 N废水处理中有较大的应用价值，也可以通过驯化提高其耐盐性，应用于海水养殖废水的脱氮。

以上研究表明，该菌株对无机氮和TN的脱除效率均较高，且对环境因子的适应性也较宽，因此，具有较大的应用潜力，后续将加强该菌在海水养殖污水处理中的实际验证。