牦牛和不育犏牛睾丸中LGR4和ZNF281基因mRNA水平的分析

于 淼，金素钰，黄 林，雷杰雯，郑玉才

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(LGR4)具有广泛的生物学功能，包括成骨、能量代谢等[1-2]，近年来被认为参与Wnt通路的信号转导[3-4].LGR4和促性腺激素受体同源，与动物生殖道发育和生殖机能相关[5-8].Qian等(2013)还报道，LGR4对精子发生是必需的[9].鉴于Wnt通路在动物发育中的重要性，LGR4在精子发生、睾丸发育中可能有重要功能.

锌指蛋白281(ZNF281)是一种锌指转录因子，也是胚胎干细胞的核心转录因子.它与Nanog等转录因子作用[10]，参与细胞的多功能性、干细胞和上皮间质转化(EMT)等调控以及DNA损伤导致的细胞应激[11-12].

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及毗邻高寒地区特有的牛种，它与普通牛的杂交后代(犏牛)生产性能显著提高，并能较好地适应高原低氧环境，但表现为回交三代内雄性不育，无法产生正常精子[13].因此，精子发生障碍被公认为与犏牛的雄性不育有直接关系.有关犏牛雄性不育的分子机制已有很多研究，犏牛睾丸中很多基因表达下调，包括在减数分裂过程中起重要作用的SYCP3、Dmc1、Dmart7等基因mRNA水平均极显著低于牦牛[13-15]，但导致精子发生障碍的因果关系至今尚不明确.我们前期研究发现，犏牛睾丸中miRNA-449水平显著低于牦牛，而其预测靶基因中包括LGR4和ZNF281等基因(李彩霞等，待发表资料).因此，本研究采用定量PCR方法比较牦牛和犏牛睾丸LGR4和ZNF281的mRNA水平，以探索其在犏牛雄性不育中可能发挥的作用.

1 材料与方法

1.1 组织采集与处理

实验成年牦牛(n=10)和犏牛(n=7)的睾丸均采自成都市青白江某屠宰场.于10月份在牦牛和犏牛屠宰后立即采集睾丸，迅速切割成小块后置于含RNA保护液(Qiagen)的EP管中，冰上带回实验室，-80℃保存备用.

1.2 睾丸总RNA提取和反转录

称取睾丸约100 mg于研钵中，用液氮充分研磨，用RNAiso Reagent试剂(TaKaRa公司)根据说明书提取总RNA.利用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和完整性.取1 μg总RNA按照RNA Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa公司)说明书反转录成cDNA，保存于-20℃.

1.3 基因的定量PCR检测

根据NCBI中普通牛18S rRNA、GAPDH、LGR4和ZNF281基因的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0软件分别设计两个目的基因和双内参18S rRNA、GAPDH基因的定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

表1 本研究PCR引物信息Table 1 Sequences of PCR primers in the present study

定量PCR在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上完成，反应体系(25 μL)：SYBRⒸGreen PCR Kit(QIAGEN 公司生产)12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，超纯水9.5 μL.反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，退火(18S rRNA和GAPDH均为60℃，LGR4为64℃，ZNF281为65℃)20 s，72℃ 15 s，共40个循环.

以反转录获得的牦牛睾丸cDNA为模板，用4对定量PCR引物分别进行常规PCR扩增，产物经10倍稀释(10-4～10-8)的5个梯度作为模板，进行反应体系和条件优化，制作标准曲线，并获得融解曲线、线性范围等参数.进一步利用建立的定量PCR方法，对牦牛和犏牛睾丸样品中目的基因和2个内参基因进行定量.样品均做两管平行，并设无模板对照.

1.4 数据统计分析

实验数据用平均值 ±标准误表示.采用 SPSS 18.0软件，根据两个内参基因18S rRNA和GAPDH表达水平的几何平均数，对LGR4和ZNF281 mRNA表达水平分别进行矫正，并以2-ΔΔCt法对数据进行处理[16].

2 结果

2.1 总RNA提取和定量PCR方法建立

实验提取的睾丸总 RNA的 A260/A280为1.8～2.0，琼脂糖凝胶电泳显示清晰的条带，且28S rRNA条带亮度是18S rRNA的约2倍，质量符合定量PCR分析的要求.常规PCR扩增显示，LGR4和ZNF281基因的PCR产物均为特异的单一条带，与预期分子量大小一致.

建立的定量PCR方法中，4个基因在较宽范围内均有很好的线性关系，其中LGR4和ZNF281基因的标准曲线的相关系数分别为0.998和0.994，扩增效率分别为96.1%和104%，融解曲线均只有1个峰(图1)，表明扩增特异性强，符合定量PCR分析要求.

图1 LGR4基因(A)和ZNF281基因(B)的融解曲线和标准曲线Fig.1 Melting curves and standard curves for LGR4 gene(A)and ZNF281 gene(B)

2.2 牦牛和犏牛睾丸LGR4和ZNF281 mRNA水平的比较

定量PCR分析表明：LGR4和ZNF281基因在牦牛和犏牛睾丸中均有较高表达.牦牛和犏牛睾丸中LGR4 mRNA水平差异不显著，而牦牛睾丸中ZNF281 mRNA水平极显著高于犏牛(P＜0.01)，相差约4.7倍(图2).

图2 牦牛和犏牛睾丸中LGR4基因和ZNF281基因的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of LGR4 gene and ZNF281 gene in the testes of yaks and cattle-yaks

3 讨论

犏牛睾丸无法产生正常的精子.已有研究表明，雄性不育犏牛睾丸中很多与繁殖相关的基因表达下调[13-15，17].利用转录组和蛋白质组学技术，也检测到牦牛和犏牛睾丸中众多差异表达基因[18-19].有报道LGR4对精子发生是必需的[9].本研究中牦牛和犏牛睾丸LGR4 mRNA水平没有统计学上的显著差异(图2A)，推测该基因可能不是导致犏牛雄性不育的主要原因.精子发生涉及复杂的基因调控网络，我们曾发现犏牛睾丸中MAPK信号转导通路中的信号分子表达显著下调[20].由于LGR4与Wnt信号通路有关，推测犏牛睾丸中该通路与精子发生障碍的直接关系不大.

锌指蛋白基因是哺乳动物基因组中最大的基因家族之一，其中一些在睾丸中表达水平高，并与精子发生相关，如 ZFP393、ZNF313、ZNF230 等[21-23].有关ZNF281的研究很少，它是重要的转录因子，在干细胞的分化中发挥重要作用[24].犏牛睾丸中ZNF281基因表达显著降低，有可能通过影响睾丸中的细胞分化而影响精子的发生，导致雄性不育.上皮间质转化是组织细胞发育中的重要机制，ZNF281可被该过程诱导，但被miR-34a抑制[11].犏牛睾丸细胞组成与牦牛不同[25]，可能是导致其ZNF281基因表达下调的主要原因.我们过去的研究也表明，另外一种锌指蛋白Prdm9在犏牛睾丸中的表达也显著下降[25]，提示雄性不育犏牛睾丸中的信号通路存在障碍.至于牦牛睾丸miRNA-449水平与ZNF281基因表达的关系需要证实.根据本研究结果，推测ZNF281基因在犏牛精子发生中可能有作用.