核桃肽对小鼠的抗疲劳作用

乌 兰，刘 睿，杜 倩，陈启贺，任金威，樊 蕊，李 勇

(北京大学公共卫生学院营养与食品卫生系，北京 100191)

疲劳是机体一种复杂生理生化的变化过程，对人们的健康状态、生存质量和工作效率会产生许多不良影响，严重时甚至会威胁人们的身心健康。随着现代生活节奏的加快，社会竞争的加剧，由于工作、学习的压力，使得疲劳成为困扰许多人的健康问题。由于疲劳的持续或反复发作，严重影响着人们正常的个人活动和社会行为，甚至长期累积疲劳引起“过劳死”，即由于过度疲劳而导致死亡的案例也屡见不鲜[1-2]。不论在我国还是世界其他国家，疲劳现象早已引起了人们的关注。因此，探讨具有缓解疲劳、抗疲劳作用的保健食品具有极其重要的现实意义。

核桃是我国由来已久的药食两用食品。我国食用核桃的历史悠久，且是核桃的发源地，从秦汉时期起一直被我国人民作为药食两用食品，明代的《本草纲目》记载：“核桃味甘性平微苦微涩，有补肾固精、健脾补血、通便润肠、宁心安神等功效”[3]。现代研究发现，核桃中不仅含有丰富的蛋白质、糖类、脂肪类成分，更含有人体需要的不饱和脂肪酸、维生素E、黄酮、叶酸、多酚类等多种生理活性成分。其中，核桃蛋白是一种具有经济、食用及药用价值的优质植物蛋白，富含丰富的营养成分，核桃中蛋白质含量约为15%，核桃蛋白中含有18种氨基酸，8种必需氨基酸种类齐全，其组成比与人体必需氨基酸含量近似，氨基酸组成中精氨酸、谷氨酸、组氨酸、酪氨酸等含量相对较高[4]。研究发现，核桃蛋白具有抗氧化、抑菌、抗病毒、降血压、抗肿瘤等功效[5]。核桃中含有多种生物活性肽，作为一种天然活性肽，其安全性高，具有极好的应用前景。段心妍[6]实验证明，核桃肽可以有效促进雄性SD大鼠体力疲劳的恢复。贾靖霖等[7]研究了核桃多肽对小鼠负重实验的影响，结果表明，小鼠负重游泳力竭时间和血清尿素氮的含量差异均极显著，表明核桃多肽具有抗疲劳作用。传统观点认为，食物中的蛋白质必须在消化道中被分解成游离氨基酸才能够被机体吸收利用，发挥其营养价值。近些年研究发现，动物消化道中蛋白质水解终产物大多是由10个或10个以下氨基酸残基组成的小分子低聚肽，不需消化分解成游离氨基酸便可直接以低聚肽的形式被机体吸收利用，比单个氨基酸的吸收更为有效，对提高蛋白质的利用率有重要作用[8]。伴随着生物化学和分子生物学技术的飞速发展，有关低聚肽的研究正逐渐引起人们的重视。但有关核桃低聚肽的抗疲劳作用尚无文献报道，故本实验通过应用不同剂量的核桃低聚肽溶液对小鼠进行的饮水干预，探讨核桃肽对小鼠抗疲劳的作用。乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分离时保留在上清液中的多种蛋白质组分的统称，包含多种蛋白及大量生物活性物质，具有增强体质、提高免疫力、抗疲劳等多种功效[9]。本实验设置乳清蛋白对照组是为避免单纯蛋白质摄入量的提高对结果的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

核桃肽，淡黄色固体粉末，主要成分为分子量小于1 000的低聚肽，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量较多，购自北京天肽生物科技有限公司。

1.2 实验动物

SPF级ICR雄性小鼠240只，18～22g，由北京大学医学部实验动物中心提供。饲养于SPF级动物室，温度范围为22±2℃，相对湿度为50%～60%，昼：夜明暗交替时间为12h：12h。实验期间动物自由进食。

1.3 实验方法

1.3.1分组及处理 动物适应性喂养1w后，按体重随机分为5个组：1个空白对照组、1个乳清蛋白组[220mg/(kg·BW)]和3个核桃肽干预组[110、220、440mg/(kg·BW)]。每日经饮水给予受试样品，空白对照组给予高压消毒蒸馏水，乳清蛋白组和核桃肽干预组给予相应浓度受试物，核桃肽和乳清蛋白溶液均用蒸馏水配制。动物每周称重2次，按体重调整受试样品剂量。受试样品给予时间30d。实验过程中每周观察各组小鼠的一般情况，包括毛色、精神状态、摄食及日常活动情况等。

30d干预结束后，每组随机分为A、B、C、D 4个亚组，A亚组进行各组小鼠血乳酸水平的检测；B亚组检测各组小鼠血清尿素氮含量、乳酸脱氢酶活力及血糖水平；C亚组为负重游泳实验，记录小鼠负重游泳力竭时间；D亚组检测小鼠肝糖原和肌糖原含量。

1.3.2血乳酸测定 小鼠尾尖采血20μL，随后不负重在30℃的水中游泳10min。再于游泳后0和20min分别采血20μL。将3次采得的血样分别加入0.48mL质量分数为1%的NaF溶液中充分混匀至透明，加入1.5mL蛋白沉淀剂，震荡混匀，3 000r/min离心10min，取上清液测定血乳酸含量。

采用自配试剂测定血乳酸含量，主要原理为在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。

1.3.3血清尿素氮和乳酸脱氢酶、血糖水平的测定 在30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后眼球采血。置4℃冰箱约3 h，血凝固后2 000r/min离心15min，取血清备用。根据试剂盒说明书进行尿素氮、乳酸脱氢酶和血糖水平的测定。

1.3.4负重游泳实验 置小鼠在游泳箱(大小约50cm*50cm*40cm)中游泳。水深不少于30cm，水温25±1.0℃，鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。

1.3.5肝糖原和肌糖原测定 处死D组动物，取新鲜肝脏和肌肉组织样本用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，精确称重，根据试剂盒说明书进行检测。

1.4 统计方法

2 结果与分析

2.1 核桃肽对小鼠体重的影响

各组小鼠开始体重和结束末次体重相比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

组别只数初次体重(g)末次体重(g)空白对照组4825.73±1.4639.08±2.47乳清蛋白组4825.40±1.9439.21±3.03低剂量组4825.18±1.6139.37±2.38中剂量组4825.18±1.5639.07±2.96高剂量组4824.95±1.4939.89±3.68

2.2 核桃肽对小鼠血乳酸含量的影响

取A亚组12只小鼠，测定小鼠血乳酸水平。如表2所示，游泳前，核桃肽低、中、高剂量组小鼠血乳酸含量均大于空白对照组(P<0.01)；游泳后20min，核桃肽低、中、高剂量组小鼠血乳酸含量均显著小于空白对照组(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，且核桃肽中、高剂量组小鼠游泳后20min血乳酸含量均显著小于乳清蛋白对照组(P<0.01、P<0.01)；核桃肽高剂量组血乳酸曲线下面积小于空白对照组(P<0.05)。

组别游泳前血乳酸值游泳后0min血乳酸值游泳后20min血乳酸值血乳酸曲线下面积值空白对照组4 240.48±1 295.497 302.38±1 383.257 700.00±1 102.50207 738.10±25 954.21乳清蛋白组5 664.94±1 523.437 283.12±1 128.885 709.09±1 287.67194 662.34±27 169.33低剂量组6 378.57±980.037 633.33±768.575 273.81±567.71a199 130.95±9 942.78中剂量组6 735.71±2 072.468 835.71±1 128.235 019.05±570.30ab216 404.76±24 982.36高剂量组6 895.24±1 895.076 930.95±1 694.364 759.52±663.10ab186 035.71±24 646.60c

注：a与空白对照组比较差异具有显著性(P<0.01)；b与乳清蛋白对照组比较差异具有显著性(P<0.01)；c与空白对照组比较差异具有显著性(P<0.05)

2.3 核桃肽对小鼠血清尿素氮、乳酸脱氢酶活性和血糖的影响

核桃肽中、高剂量组小鼠血清尿素氮均低于空白对照组(P<0.01、P<0.05)；核桃肽低剂量组小鼠乳酸脱氢酶活性高于乳清蛋白对照组(P<0.05)；核桃肽低、中、高剂量组小鼠血糖水平明显高于乳清蛋白对照组(P<0.01、P<0.01、P<0.01)(表3)。

组别尿素氮(mmol/L)乳酸脱氢酶(U/L)血糖(mmol/L)空白对照组21.13±12.381 971.29±578.626.15±2.82乳清蛋白组14.17±5.051307.71±333.038.43±1.71低剂量组16.57±11.161 834.26±810.03c5.82±1.61d中剂量组11.99±1.63b1 348.14±399.125.33±2.22d高剂量组12.56±1.28a1 277.23±347.055.19±1.90d

注：a与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)；b与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01)；c与乳清蛋白对照组比较差异有显著性(P<0.05)；d与乳清蛋白对照组比较差异有显著性(P<0.01)

2.4 核桃肽对小鼠负重游泳时间的影响

空白对照组与乳清蛋白对照组小鼠平均负重游泳时间相比较无显著差异(P>0.05)；核桃肽低、高剂量组游泳时间比空白对照组有显著延长，分别是空白对照组的2、1.7倍(P<0.01、P<0.05)(附图)。

附图 核桃肽对小鼠负重游泳时间的影响注：a与空白对照组比较差异具有显著性(P<0.01)；b与空白对照组比较差异具有显著性(P<0.05)

2.5 核桃肽对小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响

如表5所示，核中剂量组小鼠肌糖原含量高于空白对照组小鼠(P<0.05)，其他无显著性差异。

组别肝糖原含量(mg/g)肌糖原含量(mg/g)空白对照组4.72±2.742.24±0.50乳清蛋白组7.66±2.372.63±0.35低剂量组6.25±1.642.40±0.44中剂量组5.25±1.283.06±1.22a高剂量组5.55±2.042.26±0.58

注：a与空白对照组比较差异具有显著性(P<0.05)

3 讨论

躯体性疲劳是由运动引起机体一系列生化改变而导致的肌肉力量下降。抗疲劳，即延缓疲劳的产生或加速疲劳的消除。疲劳的发生及其发展变化过程伴随着一系列生化指标的改变[10]。故本实验通过检测血乳酸、乳酸脱氢酶活性、血清尿素氮和肝、肌糖原等生化指标以及负重游泳的时间，来探讨核桃肽对小鼠的缓解疲劳作用及其可能的机制。

乳酸是剧烈运动时碳水化合物在无氧条件下的糖酵解产物，在正常情况下血中乳酸浓度可维持在一定水平。随着高强度运动的增加，更高水平的乳酸可引起H+浓度的增加，并改变内部pH。pH下降会影响细胞内相关酶的活性，同时还会抑制肌质网对钙离子的释放和摄取，产生疲劳[11]。乳酸的消除途径基本包括三种[12]，即在乳酸脱氢酶作用下，乳酸转化为丙酮酸随后氧化分解成二氧化碳和水；在肝和骨骼肌内重新合成葡萄糖和糖原；在肝内合成脂肪酸等其他物质。在本研究中，服用核桃肽低剂量组的小鼠乳酸脱氢酶活性高于乳清蛋白对照组，但该组小鼠血乳酸含量并未明显下降，可能是核桃肽并未全部通过乳酸脱氢酶途径消除掉体内产生的乳酸。但核桃肽高剂量组血乳酸含量有所下降，可提示核桃肽有减缓疲劳的作用。

血清尿素氮是肾功能能量代谢的产物，较长时间运动后，当糖、脂肪代谢不能供给机体足够的能量时，蛋白质和氨基酸分解代谢加强，导致机体中血尿素氮含量增加。体内尿素氮和身体耐力之间呈正相关。即表示身体承受运动耐力越差，尿素氮水平增加越多，故血清尿素氮是评估疲劳水平的敏感指标[13]。本研究中核桃肽中、高剂量组小鼠血清尿素氮水平均低于空白对照组，表明核桃肽可减少血清中尿素氮的堆积，可提示核桃肽有提高身体承受运动耐力的能力，能有效缓解疲劳。

糖是人体最重要的能源物质，主要包括肌糖原、肝糖原和血糖。其中，肌糖原是维持肌肉运动的重要能源，肝糖原分解是血糖维持稳定的重要保障[14]。正常运动时机体的能量提供主要来自于糖原的分解，糖原储备量对于运动具有十分重要的作用，因此肝糖原和肌糖原是与疲劳相关的敏感指标[15]。研究发现，肌糖原消耗增加时，机体将分解肝糖原产生葡萄糖进入血液，以维持血糖水平。但是当肝糖原储备耗竭时，机体不能维持正常的血糖水平，也会导致大脑产能不足，从而功能受抑制[16]。在本研究中，核桃肽低、中、高剂量组小鼠血糖水平明显高于乳清蛋白对照组，提示核桃肽可提高一定程度的血糖水平，提高缓解疲劳能力。核桃肽中剂量组小鼠肌糖原含量高于空白对照组小鼠，可提高肌糖原储备，提高运动耐力，达到抗疲劳作用。

疲劳的最主要表现是运动耐力的下降，运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标[10]。负重游泳实验是评估身体耐受力最常用的动物模型实验，且减少疲劳的敏感性与游泳时间相关[17]。负重游泳时间越长，表示抗疲劳的能力越强。本次研究中，核桃肽低、高剂量组游泳时间比空白对照组有显著延长，表明核桃肽提高了小鼠的运动耐力，即提高了小鼠的抗疲劳能力。此外，本实验中核桃肽低剂量组干预仅提高了乳酸脱氢酶活性和负重游泳时间，核桃肽中剂量组干预可增加小鼠肌糖原含量，而核桃肽高剂量组干预可改善与疲劳相关的多个指标，如血乳酸含量、血清尿素氮含量及负重游泳时间，可能提示干预效果与剂量之间存在线性关系。

以上结果表明，核桃肽可通过减少体内乳酸的堆积降低血乳酸水平，通过延长负重游泳时间和有效清除血清尿素氮的含量提高身体承受运动耐力的能力，通过提高肌糖原的含量稳定维持肌肉运动的能力来源，从而起到提高小鼠抗疲劳能力的作用。

综上，本实验通过对小鼠进行核桃低聚肽的干预，发现了核桃低聚肽对小鼠的抗疲劳作用，但其中机制未能明确，需根据进一步的研究进行探讨。

4 结论

综上所述，本研究通过设立空白对照组和乳清蛋白组作为对照组，探讨核桃肽的抗疲劳作用。结果表明，核桃肽可提高乳酸脱氢酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原储备量，显著延长负重游泳时间，具备一定的缓解疲劳的作用。但未能明确核桃肽抗疲劳作用的机制，其有待进一步的探讨。◇