助孕丸质量标准提高研究

许桂丽 段靖 刘梅 鲁毅 杨波 周燕萍 王亚威

助孕丸为我院自制制剂，由熟地黄、赤芍、白芍、当归等十九味中药材组成，其功能主治为养血活血，益肾健脾；用于黄体功能缺陷，子宫发育不良等症的治疗。在现质量标准中，仅对赤芍、熟地黄两味药材进行定性鉴别，难以全面控制制剂质量。本次试验修订了现标准中的TLC方法，并新建了白芍、当归、川芎的薄层鉴别方法；赤芍、白芍均为方中主要药材，芍药苷为其共有活性成分，本试验采用高相液相色谱法测量制剂助孕丸中芍药苷的含量，为整体控制该产品质量提供标准和技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪（Agilent ）、KH-100超声清洗器（昆山禾创）、FA-2004N电子分析天平（上海精科）、DZF-6050真空干燥箱（上海精宏）、CPA225D电子分析天平（Sartorius）。

1.2 试药

熟地黄对照药材（生产批号：121196-201406）；赤芍对照药材（生产批号：121093-201303）；白芍对照药材（生产批号：120905-201610）川芎对照药材（生产批号：120918-201612）；当归对照药材（生产批号：120927-201617）；芍药苷对照品（生产批号：110736-201842），购自中国食品药品检定研究院；助孕丸（200 g/袋，中国人民解放军第454医院）；乙腈是色谱纯，其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 熟地黄的薄层色谱鉴别 称取助孕丸5 g，研至细粉，加水50 ml，微热使充分溶散，煮沸，放冷后使用滤纸过滤，乙酸乙酯提取2次，每次用量为30 ml，合并两次提取液，蒸干溶剂后加甲醇1 ml将残渣溶解，制备出供试品溶液。取2 g熟地黄对照药材，加水50 ml，煎煮30分钟后冷却，同法完成对照药材溶液制备。取除去熟地黄药材的其他药材制成的阴性制剂，同法获得阴性对照溶液。照TLC法《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，量取以上溶液各10 μl，在同一硅胶G薄层板上分别点样，选用乙酸乙酯-二甲苯（1：1）作为展开剂，待展开后取出薄层板，自然晾干，用二硝基苯肼乙醇试液喷洒显色。观察结果，供试品色谱中，与熟地黄对照药材色谱相应的位置上，有相同的淡黄色斑点出现[1-3]，阴性对照色谱无此斑点。见图1。

2.1.2 赤芍、白芍的TLC鉴别 取助孕丸5 g，研碎，加乙醇30 ml，振摇10分钟，过滤，蒸至溶剂剩余约1 ml，制备出供试品溶液。取白芍、赤芍对照药材各0.6 g，混合，加乙醇20 ml，同法完成对照药材溶液制备。取除去赤芍、白芍药材的其他药材制成的阴性制剂，同法完成阴性对照溶液制备。照TLC法试验，分别量取所制溶液各10 μl，点于同一块硅胶G薄层板上，选用三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯－甲酸（40：10：5：0.2）为展开剂，待展开后取出薄层板，自然晾干，用香草醛硫酸溶液（5%）喷洒显色，放于烘箱加热至105℃，待显示出清晰斑点。结果显示，供试品色谱中，和混合对照药材TLC色谱相应的位置上，有相同的蓝紫色斑点出现[4-7]，阴性对照色谱无此斑点，见图2。

2.1.3 川芎、当归的TLC鉴别 取助孕丸粉末10 g，加乙醚60 ml，振摇10分钟后滤纸过滤，蒸干，取1 ml乙醇将残渣溶解，制备出供试品溶液。取川芎、当归对照药材各1 g，加乙醚20 ml，同法完成混合对照药材溶液制备。取除去赤芍、白芍药材的其他药材制成的阴性制剂，同法完成阴性对照溶液制备。照薄层色谱法试验，量取所制溶液各10 μl，同一硅胶G薄层板上分别点样，选择正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，待展开后取出薄层板，自然晾干，放于紫外光灯（365 nm）下查看结果。供试品色谱中，与混合对照药材色谱相应位置上，有相同颜色荧光斑点出现[8-11]，阴性对照色谱无对应的斑点。见图3。

2.2 芍药苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为：InertSustain C18（5 μm，4.6×250 mm），乙腈-0.1%磷酸溶液（13：87）为流动相，流速为1.0 ml/min。检验波长为230 nm[12-14]。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

2.2.2 溶液的制备 对照品溶液制备 精密量取芍药苷对照品适量，甲醇溶解，制成每1 ml含芍药苷0.53 mg的溶液，即得。

供试品溶液制备 精密称取助孕丸7.0 g，放于具塞锥形瓶中，精确加入50 ml甲醇，密塞并称定重量，浸泡3.5 h后超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀后用滤纸过滤，取续滤液，即得。

阴性对照溶液制备 取2.1.3中阴性制剂适量，同法完成阴性对照溶液制备。

2.2.3 专属性试验 按2.2.1色谱条件取助孕丸供试品、芍药苷对照品、阴性对照溶液各10 μl进样，阴性对照色谱中，在芍药苷相应的出峰时间处无干扰峰出现。见图4。

图1 熟地黄的TLC图谱

图2 赤芍、白芍的薄层色谱鉴别图

图3 川芎、当归的薄层色谱鉴别图

表1 助孕丸加样回收率试验结果（n=6）

表2 助孕丸中芍药苷含量

图4 助孕丸HPLC

2.2.4 线性关系考察 分别量取“2.2.2”项下芍药苷对照品溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml，放于10 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制备出对照品溶液。取上述对照品溶液各10 μl，精密称定，按2.2.1色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 050.9X+154.0，r=0.999 9；结果表明芍药苷在1.06～5.30 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取芍药苷对照品溶液10 μl，连续进样6次，对照品溶液峰面积的RSD为0.60%，表明精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一助孕丸供试品溶液，分别在0、8、16、24、48 h各进样10 μl，测定峰面积，考察溶液稳定性，RSD为1.20%，表明供试品溶液至少在48小时内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一供试品，按“2.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，依次测定，得出助孕丸中芍药苷含量，RSD为1.00%，结果表明重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的助孕丸供试品（2.21 mg/g）2.00 g，6份，分别精密加入芍药苷4.40 mg，依法检测，算出回收率，结果见表1。

2.2.9 供试品含量测定 按“2.2.2”项方法制得助孕丸供试品溶液10批，按上述色谱条件测定，计算其所含芍药苷量，结果见表2。由表2可知，助孕丸中芍药苷含量最低2.14 mg/g，以最低测定值的80%为限，故拟助孕丸中含芍药苷不得低于1.71 mg/g。

3 讨论

3.1 定性物质的选择

助孕丸处方包含十九味中药材，成分繁杂，薄层鉴别干扰因素众多，参考同类试验相关资料及摸索试验步骤，筛选出薄层色谱效果较好的熟地黄、赤芍、白芍、当归和川芎，故选择该5种药材作为薄层色谱鉴别成分。由于当归和川芎中都存在活性成分-蒿苯内酯，如果分开点样阴性对照会相互干扰，现将当归、川芎两种药材合并鉴别，当归、川芎使用双阴性对照进行薄层鉴别的方法在药典中早有收载[15]。

3.2 定量物质的选择

赤芍和白芍均为方中主要药味，两者都含有芍药苷，芍药苷具有扩张血管；镇痛镇静；抗炎抗溃疡等作用。参考相关文献和中华人民共和国药典（2015年版），均采用芍药苷作为赤芍和白芍的定量物质，判断其药材优劣的重要指标。本实验选择芍药苷作为助孕丸的定量物质，以期对制剂质量作出全面的评价。

3.3 供试品提取方法的选择

甲醇作为提取助孕丸中芍药苷的溶剂，比较超声处理30 min、60 min和90 min时提取效果。其他条件相同，超声时间为60 min、90 min时，助孕丸中芍药苷成分能充分提取。故本试验选择甲醇作为提取溶剂、超声处理60 min作为供试品的提取方法。

3.4 流动相的选择

查阅参考文献[12-14]，流动相中乙腈含量高时，芍药苷分离效果不明显；适当降低乙腈比例，选用乙腈-0.1%磷酸（13：87）、流速1 ml/min作为流动相时，芍药苷与其他组分可完全分离，达到较佳的结果。

TLC法可鉴别助孕丸中的熟地黄、赤芍、白芍、当归和川芎等五种药材，操作方法简便可行，可成为助孕丸的定性鉴别方法；HPLC法测定助孕丸中芍药苷的含量，操作简单易行，结果稳定准确，可作为助孕丸的含量测定方法。