大蒜粗提物挥发性成分分析及其对辣椒疫病的控制作用

季文平 陈夕军* 何 超 贺 振 魏利辉 刘邮洲 张 青 黄奔立*

（1扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009；2江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京210014；3苏州市农业科学院，江苏苏州 215155）

辣椒是人们日常生活中的重要蔬菜之一，在世界各地广泛栽培。我国是辣椒主要种植国，鲜辣椒和干辣椒均是我国外贸出口的重要产品，产品远销新加坡、菲律宾、韩国和日本等国。近年来，我国辣椒种植面积不断扩大，已达150万hm2左右，且有进一步扩展的趋势（郑井元 等，2018）。但由辣椒疫霉（Phytophthora capsiciLeonian）引起的疫病降低了辣椒的产量和品质，制约了辣椒产业的进一步发展（Wang et al.，2016）。

辣椒疫病是一种土传病害，主要以卵孢子在土壤病残体中越冬，当土温高于18 ℃，气温在24～29 ℃且空气湿度较大时，该病扩展迅速，病菌孢子囊和游动孢子可通过气流和雨水快速传播（Jiang et al.，2006；Babadoost et al.，2016；Koc et al.，2017）。因该病在田间暴发性强，化学防治便以其方便、快捷、高效而成为防治措施中的首选。近几十年来，已有多种新型杀菌剂在生产上加以应用，但随着用药时间的延长和用药频率的增加，辣椒疫病菌已对这些药剂产生了抗药性，且化学药剂易造成食品与环境污染，也不符合人们对于安全、优质农产品与生态环境的需求。因此，寻找可有效控制辣椒疫病的生物源物质显得尤为迫切。

生物源物质指来源于动物、植物和微生物及其次生代谢物，或经过改造仿生合成的高活性、强特异性物质。因其来源于自然界，对环境相对友好，从而被开发成农药、肥料、生长调节剂和生物诱抗剂等（汤日圣 等，2006；Hubert et al.，2008；郭默然，2014；Singh & Strong，2015）。大蒜作为一种中药与调味料，其粗提物甚至某些化学组分已被证明有药用与杀菌的功能，如大蒜素和阿霍烯等（Singh &Chauhan，1992；Bagul et al.，2015；Edward et al.，2017）。这些物质在高浓度时可抑制真菌菌丝生长、孢子囊形成与孢子萌发，并与病菌细胞内带有巯基的化学物质结合，从而降低病菌体内氨基酸的摄入量、氧气的消耗量及酸性和碱性磷酸酯酶的活性（Miron et al.，2000）。但大蒜粗提物成分复杂，究竟哪些物质在其中起主要作用，还并不十分清楚。本试验拟通过对大蒜粗提物抗菌成分进行分析，找到适用于辣椒疫病防控的大蒜次生代谢物质，从而为新型农药的研制与辣椒疫病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒品种为茄门甜椒（购于扬州市蔬菜种子有限公司），易感辣椒疫病。用55 ℃温水浸泡辣椒种子3～4 h，清水淋洗后将种子放入垫有潮湿纱布的培养皿中，26 ℃恒温培养箱中催芽。待种子露白后穴播于装有伯爵泥炭BM-2育苗基质的塑料穴盘中，每穴3～4粒种子，22～24 ℃温室中培养至6片真叶，备用。

大蒜品种为白皮蒜，购自扬州市区农贸市场。将蒜种点播于装有营养土的塑料花盆中（盆口直径14 cm，高10 cm），每盆4瓣，22～24 ℃温室中培养至5片叶，备用。

辣椒疫病菌YM-103，分离自江苏辣椒疫病病株，经形态与分子生物学鉴定，并通过柯赫氏法则验证。

1.2 大蒜粗提物的制备

大蒜植株拔起、洗净后晾干，将植株分成根、茎叶和鳞茎3部分，取根、茎叶和鳞茎各30 g，剪碎后分别加入少量石英砂研磨。经减压抽滤后，用无菌水将滤液定容至20 mL，配制成1 500 mg·mL-1母液，经细菌滤器过滤后备用。

1.3 大蒜粗提物对辣椒疫病菌生长的抑制作用测定

在90 mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中加入大蒜粗提物母液，配制成含粗提物浓度为37.5、75.0、150.0 mg·mL-1的培养基，制成平板。用打孔器从活化的辣椒疫病菌菌落边缘取直径5 mm的菌丝块，置于含大蒜粗提物的平板中央，28℃恒温培养箱中黑暗培养，2 d后开始测量直径，每隔24 h测量1次，共测量4次，计算抑菌率。每处理4次重复，以清水作对照。

1.4 大蒜粗提物对辣椒疫病的防效测定

1.4.1 辣椒疫病菌孢子悬浮液的制备 参照Chen等（2011）的方法制备辣椒疫病菌孢子悬浮液：将辣椒疫病菌活化后接种于胡萝卜琼脂培养基，25℃恒温培养箱中黑暗培养4 d，再置于光照培养箱中同温度培养2 d。向培养皿中加入10 mL无菌水，放置于室温下10 min，4 ℃下10 min，室温下20 min，即有大量游动孢子释放。将孢子洗下，经两层纱布过滤后加无菌水稀释，配制成含孢子1×106个·mL-1的孢子悬浮液用于接种。

1.4.2 大蒜粗提物的防效测定 将长势一致的6叶期辣椒苗移栽至装有灭菌土的塑料盆中，7 d后接种辣椒疫病菌，每株浇灌孢子悬浮液10 mL。1 h后，分别将配制好的大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物37.5、75.0、150.0 mg·mL-1倒入辣椒苗近基部土壤中，每盆15 mL，每处理10盆，3次重复，以倒入清水作对照。保湿24 h，7 d后调查发病情况，计算病情指数与防治效果。辣椒疫病严重度分级标准（Chen et al.，2011）：0级，无病症；1级，幼苗根部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级，幼苗根茎部变黑达1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级，幼苗根茎部变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级，幼苗根部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或植株萎蔫；5级，整株枯死。

1.5 大蒜粗提物中挥发性物质的成分测定

称取大蒜根、茎叶、鳞茎各20 g，分别加入200 mL去离子水于组织粉碎机中粉碎，将粉碎的样品倒入250 mL锥形瓶中，加入转子，用封口膜密封，放在40 ℃恒温磁力搅拌器上快速搅拌。将固相微萃取装置（美国Supelco公司）的萃取头（PDMS，100 μm）针头插入封口膜，并小心将萃取头推出，同时用铁架台固定固相微萃取手柄。自萃取头推出后开始计时，对挥发物提取2 h。在萃取头捕集样品前，先将其在气相色谱进样口内（250℃）热解吸20 min，以保证萃取头中无杂质和其他污染物。

气相色谱检测条件：毛细管柱为美国惠普公司HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），GC进样口温度为280 ℃，炉温程序升温至50 ℃并保持3 min，然后以8 ℃·min-1的速度升温至300 ℃，保持3 min；EI离子源，离子源温度280 ℃，载气为氦气（流速1 mL·min-1），电子轰击能量70 eV，质量扫描范围50～550 amu，不分流。

对大蒜粗提物总离子流图中的峰面各进行归一化法测量，明确各组分的百分含量，各组分图谱在NIST谱库中自动检索后选用高相关结果。

1.6 外源添加的硫醚类有机硫化物对辣椒疫病菌生长的抑制作用测定

分别配制含10、20、50、100 mg·L-1的甲基丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的含药培养基，制成平板。在刚刚活化好的辣椒疫病菌菌落边缘取5 mm菌丝块接种至平板中央，28 ℃恒温培养箱中黑暗培养，4 d后测量菌落直径，以空白培养基作对照，按1.3的方法计算抑菌率。每处理4次重复。

1.7 与大蒜轮作对辣椒疫病的控制效果测定

2010～2016 年在扬州大学农场蔬菜田进行轮作试验，3月上旬移栽茄门甜椒，辣椒苗移栽后15 d用含孢子1×106个·mL-1的孢子悬浮液灌根接种，保持田间湿度，待田间植株普遍发病后（病株率＞80%）进入正常管理，作为病田土备用。同年9月中旬，在清除田间病残体后，分别种植大蒜和茄门甜椒。次年3月上旬，分别取大蒜田和茄门甜椒田表层土（＜20 cm）装盆（盆口直径14 cm，高10 cm，装土1 000 g）备用。将长势一致的茄门甜椒苗（6叶期）移至装有病土的盆中，每盆1株，每种病土栽种10盆，3次重复。保湿24 h，7 d后调查发病情况，计算病情指数与防治效果。

1.8 与大蒜混栽对辣椒疫病的控制效果测定

将辣椒疫病病茎剪成0.5 cm小段，每盆加入10 g与灭菌土混匀，模拟田间病残体，将长势一致的大蒜（5叶期）与茄门甜椒（6叶期）混栽于盆中，两植株相距5 cm，以单独移栽甜椒苗为对照。每处理10盆，3次重复，保湿24 h，25 ℃温室中培养30 d后调查发病情况，计算病情指数与防治效果。

1.9 数据统计分析

所有数据的方差分析与多重比较均使用DPS V6.55软件进行。

2 结果与分析

2.1 大蒜粗提物对辣椒疫病菌生长的抑制作用

由表1可知，不同浓度的大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物对辣椒疫病菌均有很好的抑制作用，且浓度越高，抑制作用越强。3种粗提物中，以大蒜鳞茎粗提物抑制作用最强，浓度为150.0 mg·mL-1时，菌丝不再生长。除了150.0 mg·mL-1的鳞茎粗提物在培养5 d后对辣椒疫病菌的抑制率仍为100.00%外，茎叶、根粗提物以及鳞茎低浓度粗提物均随时间推移对病菌的抑制率有所下降。这一结果表明，大蒜粗提物中的抑菌物质可能是一些挥发性物质，随着时间的推移因物质挥发而抑制作用下降。

表1 不同浓度大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物对辣椒疫病菌生长的抑制作用

2.2 大蒜粗提物对辣椒疫病的防治效果

大蒜不同部位粗提物对辣椒疫病均有一定防治效果，且浓度越高，防治效果越好。在所有粗提物中，以150.0 mg·mL-1鳞茎粗提物的防效最高，达59.38%；茎叶粗提物浓度为37.5 mg·mL-1时，防效仅为19.17%；相同浓度大蒜不同部位粗提物，均以鳞茎粗提物对辣椒疫病的防治效果最好，与其他部位粗提物防效差异显著（图1）。

图1 大蒜不同部位粗提物对辣椒疫病的防治效果

2.3 大蒜粗提物主要化学成分分析

图2 大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物挥发性成分总离子流图

对大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物挥发性物质进行GC-MS分析，得到各粗提物总离子流图（图2）。 结果表明，大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物中挥发性物质均以硫化物为主，分别占总挥发性物质的92.14%、90.65%和92.85%，但其组成成分和含量有明显差别。根粗提物中挥发性物质有20种，主要成分为二烯丙基二硫醚（46.73%）、二烯丙基硫醚（15.73%）、2，4-二甲基噻吩（8.51%）、草胺酰肼（7.25%）、1，2-二硫环戊烷（7.21%）和三硫代碳酸亚乙烯酯（5.93%）；茎叶粗提物中挥发性物质有19种，主要成分为二烯丙基二硫醚（45.15%）、二烯丙基硫醚（19.03%）、草胺酰肼（8.83%）、三硫代碳酸亚乙烯酯（6.55%）；鳞茎粗提物中挥发性物质有23种，主要成分为二烯丙基二硫醚（51.86%）、二烯丙基硫醚（15.59%）、2，4-二甲基噻吩（12.09%）和三硫代碳酸亚乙烯酯（5.99%）（图2、表2）。由表2可知，大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物中的硫化物以一硫化物和二硫化物为主，一硫化物以二烯丙基硫醚为主，二硫化物以二烯丙基二硫醚为主，而在大蒜根、茎叶粗提物中均大量存在的草胺酰肼在鳞茎粗提物中并不存在，在大蒜根、鳞茎中均大量存在（10%左右）的2，4-二甲基噻吩在茎叶中的含量只是根、鳞茎的1/5左右。

表2 大蒜根、茎叶和鳞茎中挥发性物质成分及相对含量

2.4 外源添加几种硫醚类有机硫化物对辣椒疫病菌生长的影响

向培养基中加入甲基丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚后，辣椒疫病菌的生长均受到明显的抑制，且浓度越高抑制作用越明显。在低浓度情况下，几种有机硫化物对辣椒疫病菌生长的抑制作用差异并不明显，但二烯丙基三硫醚在100 mg·L-1浓度下对辣椒疫病菌的抑制作用要明显高于其他几种硫化物，达60.55%（图3）。这一结果表明，在大蒜粗提物对辣椒疫病菌生长的抑制过程中，多种有机硫化物参与了作用，且与其他硫醚类有机硫化物相比，二烯丙基三硫醚具有更强的抑菌作用。

2.5 大蒜与辣椒轮作或混栽对辣椒疫病的控制效果

将大蒜与辣椒轮作或混栽对辣椒疫病有很好的控制效果（表3），防效分别达59.81%和62.09%，说明采用与大蒜轮作或混栽的方式是田间防控辣椒疫病的一种有效手段。

图3 不同硫醚类有机硫化物纯品对辣椒疫病菌生长的影响

表3 大蒜与辣椒轮作或混栽对辣椒疫病的控制效果

3 结论与讨论

大蒜既是人们喜欢的食品，也是一种广泛用于治疗各种疾病的药用植物，甚至对人的学习能力与记忆力均有促进作用（Roychoudhury et al.，1993；张庭廷 等，2007；Mukherjee & Banerjee，2013；Bagul et al.，2015）。对大蒜中活性成分的研究始于1844年，德国化学家Theoder Wertheim利用水蒸气蒸馏大蒜得到了一些挥发性物质，并确定其为烯丙基硫化物。后来国内外学者分别采用水蒸气蒸馏法（或同时蒸馏法）、有机溶剂浸出法、超临界二氧化碳萃取法等从大蒜中提取到不同的风味物质，如小分子硫醚化合物、蒜氨酸、二烯丙基硫代亚磺酸酯（大蒜素）、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物和二烯丙基四硫化物等（Amagase et al.，2001）。但不同提取方法所得各物质含量并不相同。乙醇提取法所获得的大蒜提取物主要成分为3-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯和2-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯，约占提取物总量的55.80%，二烯丙基二硫化物仅占4.58%，二烯丙基三硫化物为1.46%；而同时蒸馏法所得提取物则以二烯丙基二硫化物含量最高，占28.28%，3-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯和2-乙烯基〔4H〕-1，2-二噻烯的含量只占0.44%和1.04%（韩月峰，2007）。不同提取方法所得产物及其含量差异较大可能是由于蒸馏法操作温度高、操作时间长，从而使得许多化学成分分解；而有机溶剂浸出法则因为溶剂的极性，使得提取并不完全。本试验对大蒜组织进行破碎后直接连接至固相微萃取装置，并连接气相色谱仪测定其挥发物，时间短、成分没有散失，应能更准确检测大蒜粗提物中挥发物的种类及各物质含量。

作为医药，大蒜广泛应用于保护动物心脏免受阿霉素诱导的中毒，通过影响肝脏相关生物转化酶和抗氧化剂活性来改变癌症的进程，亦或用来缓解因化学农药导致的生殖毒性等（Arivazhagan et al.，2000；Alkreathy et al.，2010；Assayed et al.，2010）。近年来，大蒜提取物也被逐步应用于植物病害的防治。生物测定表明，大蒜提取物对许多植物病原菌，如土壤杆菌、欧文氏菌、假单胞菌、黄单胞菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌、灰梨孢菌、青霉菌、霜霉菌和疫霉菌均有抑制作用（Curtis et al.，2004；Daniel et al.，2015）。 大 蒜鳞茎提取物对辣椒疫病菌的抑制作用主要表现在抑制菌丝生长和孢子萌发，并对其菌丝有破坏作用，造成菌丝肿大、原生质凝集和菌丝体渗透率增高等（Su & Cheng，2008）。施用于田间，大蒜提取物对辣椒疫病、番茄灰霉病、番茄叶霉病、西瓜枯萎病等均有很好的控制效果，特别是对辣椒疫病，无论是抗性品种还是感病品种，大蒜粗提物对其预防与治疗效果均达80%以上，150.0 mg·mL-1处理浓度下，对抗病品种辣椒疫病的预防效果甚至达到100%（Curtis et al.，2004；程智慧 等，2008；Su & Cheng，2008；尉婷婷 等，2010；Wei et al.，2012；Daniel et al.，2015）。但所有这些研究均是以粗提物或混合物为对象，有关大蒜提取物中到底是哪一种物质或哪几种物质在混合起作用，且其不同部位提取物是否不同并没有详细报道。本试验通过气相色谱明确了大蒜根、茎叶和鳞茎中挥发性物质的种类和各物质含量并不相同，但均以硫醚化合物为主，占60%以上。且这些硫化物对辣椒疫病菌的生长均具有很好的抑制作用。将大蒜与辣椒轮作或混栽，这些硫化物可很好地控制辣椒疫病的发生，防效可达60%左右。这些结果说明大蒜挥发性物质在辣椒疫病的绿色防控上有很好的应用前景。