生物炭添加对马铃薯根际土壤真菌多样性和产量的影响

黄修梅 李 明* 戎素萍 胡 云 杨 进 张艳彦

（1内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014019；2乌兰察布市种子管理站，内蒙古乌兰察布011800）

内蒙古是我国马铃薯主产区之一，规模化和集约化生产给企业和种植户带来经济效益的同时，也使土壤中微生物多样性减少，土传病害严重，马铃薯产量与质量下降，危害马铃薯产业的健康发展。内蒙古也是我国玉米的主产区，每年产生大量的玉米秸秆，利用玉米秸秆制备生物炭在土壤改良和促进作物生长等方面的应用价值已被很多研究证实（王欣 等，2015）。生物炭自身富含有机碳和一定量的矿物质养分，具有微孔结构和官能团以及较大的比表面积（夏亚真 等，2018），可改善土壤理化性质和生物学特性，提升土壤肥力，增加土壤营养元素，改善离子交换量，为有益微生物提供良好的生态环境，使作物产量得到提高（李明 等，2016）。土壤微生物群落在土壤生态系统中发挥着极其复杂的作用，也是影响土壤健康的一个重要因素（van Zwieten et al.，2010）。真菌是土壤微生物的主要组成部分，可以有效降解土壤中复杂组分和凋落物（邢来君和李明春，2001）、驱动养分循环（盛玉钰 等，2018）、促进作物生长（李发虎 等，2017）。因此了解生物炭如何影响土壤微生物生长和作物产量对于确保土壤质量、维持土壤子系统的完整性至关重要。本文采用高通量测序技术，研究玉米秸秆生物炭改良土壤对马铃薯根际土壤真菌群落结构和产量的影响，以期为生物炭在土壤改良和马铃薯优质高产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为内蒙古马铃薯主栽品种克新1号原原种。供试生物炭购自辽宁金和福农业开发有限公司。当年产的玉米秸秆在半封闭低温炭化炉内400℃缺氧条件下燃烧8 h，主要性质为：C、N、H质量分数分别为47.17%、0.71%、3.83%，碳氮比为67.03，pH值为9.04，有机质、速效磷、碱解氮和速效钾含量分别为925.74、394.18、159.15、783.98 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验于 2016～2017年在内蒙古农业大学科技园区进行。采用田间试验法，共设4个处理：T1为对照（CK），不添加生物炭；T2、T3和T4分别为播种前在土壤表层0～30 cm 处均匀添加10、20、40 t·hm-2生物炭。4月25日播种马铃薯，行距70 cm，株距33 cm，小区面积16 m2，随机区组排列，3次重复，田间管理同常规大田管理。

1.3 指标测定

在马铃薯收获时（9月5日），去除表面土壤，用抖落法分别取各处理的9株样地根际0～20 cm处土壤均匀混合，测定真菌物种群落。同时，测定马铃薯单株产量、单株结薯数、商品薯率。真菌菌群测定采用ITS（internal transcribed spacer）高通量测序平台，遵循Illumina测序仪文库构建方法，以ITS2为目标区域进行引物设计，50 ng的DNA模板、25 μL PCR体系，Phusion酶扩增25～35个循环，一轮PCR扩增反应后，在正反向引物两端分别加上不同Barcode以区分不同的样本，扩增后的PCR产物使用Beads纯化，用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer试剂盒做归一化处理，将构建好的文库上样cBots或簇生成系统，用于簇生成及MiSeq测序。对于MiSeq测序的双端数据首先根据Barcode信息进行样品区分，然后根据Overlap关系进行Merge拼接成Tag，接着进行数据过滤、Q20和Q30质控分析，对最终Clean数据进行OTU（operational taxonomy unit）聚类分析和物种分类学分析。

商品薯率测定：按大小分级，75 g以上为商品薯，商品薯率即商品薯所占的质量百分比。于9月5日实收测单株产量，统计单株结薯数。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel和SPSS 19.0软件进行分析。采用11.3版本的RDP（Ribosomal Database Project）数据库进行真菌物种分类分析。

2 结果与分析

2.1 生物炭对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响

对4个处理土壤进行测序共获得原始序列108 729条，筛选后获得优质序列108 517条。其中T1～T4处理高质量序列分别为11 056、10 396、49 236、37 829条。OTU即可操作分类单元，为用于物种分类及物种相对丰度分析的基本单元。如图1所示，随着测序量的不断增大，各样品OTUs数目的增加趋于平缓，达到饱和，说明测序数据量合理，能够真实地反映土壤样本的真菌群落。

图1 不同处理土壤真菌的稀释曲线

Chao1指数常用来估计物种总数，其数值越大，表示物种种类越多。Shannon指数，也称香浓指数，不只关心物种丰富度，同时关心物种的均匀度。Simpson指数用于分析微生物群落的优势度，其数值越大，说明微生物的优势越明显。对真菌群落多样性的非参数估计表明（表1），添加生物炭各处理的Chao1指数明显低于对照（T1），表明添加生物炭处理后土壤真菌群落物种总数明显下降，其中T3处理最低，比对照降低41.1%。添加生物炭处理的Simpson指数和Shannon指数均低于对照，表明添加生物炭后，土壤真菌的丰富度或均匀度明显下降。

表1 生物炭处理对根际土壤真菌多样性指数的影响

图2为反映各处理土壤真菌物种进化关系的系统发育进化树，通过颜色梯度及相似程度来反映生物炭处理在各分类水平上真菌群落组成的相似性、多样性及丰富度。进化树环形部分文字为分类等级，由内到外等级由低到高，节点大小表示丰度高低，绿色覆盖区域表示低丰度，红色覆盖区域表示高丰度。从图2可知，与对照（T1）相比，各生物炭处理红色区域减少，绿色区域增多，其中T3 处理内外的红色覆盖区域最少，说明该处理真菌丰度最低。

2.2 生物炭对马铃薯根际土壤真菌组成及其丰度的影响

图2 不同处理根际土壤真菌物种系统发育进化树

物种组成分析反映样品在不同分类学水平上的群落结构，4个处理马铃薯根际土壤的真菌共包含5个门、25个纲、62个目、120个科、201个属和345个种。在门分类水平上，马铃薯根际土壤真菌包含子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、壶菌门（Chytridimycota）和球囊菌门（Glomcromycota）。由表2可知，在门分类水平上构成马铃薯根际土壤的优势真菌群落为子囊菌门，相对丰度为86.86%～95.86%，平均为91.76%，其次为担子菌门和接合菌门，壶菌门和球囊菌门的丰度不足1%，无法分类和鉴定的杂菌占2.74%。与对照（T1）相比，T2～T4处理降低了担子菌门和接合菌门的丰度，T3～T4处理增加了子囊菌门的丰度。

统计各样本在科分类水平上丰度＞1%的真菌群落，结果表明（表3），构成马铃薯根际土壤的真菌优势群落主要有粪壳菌目Incertae sedis 23、子囊菌科、粪壳菌科、粪壳菌目Incertae sedis、小子囊菌科、蜘蛛菌科、毛壳菌科、丛赤壳科、毛球壳科、肉座菌目无法识别的科，占全部菌落的1.68%～27.10%。与对照（T1）相比，T2～T4处理粪壳菌目Incertae sedis 23、小子囊菌科、毛壳菌科、丛赤壳科占总数的比例明显提高；子囊菌科、粪壳菌科、粪壳菌目Incertae sedis占总数的比例呈明显下降趋势。

表2 不同处理真菌在门分类水平上的丰度比较

2.3 生物炭对马铃薯产量的影响

如表4所示，不同生物炭添加量对马铃薯单株产量、单株结薯数、商品薯率影响较大。与对照（T1）相比，T3处理显著提高了马铃薯单株产量，比对照提高106.3%；各处理均显著提高了马铃薯单株结薯数，其中T4和T3处理较高，分别比对照显著提高了79.3%和58.6%；商品薯率以T2和T3处理较高，分别比对照显著提高了64.3%和65.4%。综合产量指标，不同生物炭添加有利于马铃薯单株产量和商品薯率的提高，T3处理的增产效果最显著。

表3 不同处理真菌在科分类水平上的丰度比较

表4 生物炭对马铃薯产量的影响

3 结论与讨论

土壤微生物及其活性对于土壤功能至关重要。真菌是微生物的重要组成部分，在与宿主植物相互作用中扮演着重要的角色，在有机物质分解、养分循环及交换过程中起着基础作用。研究表明，生物炭处理土壤后，土壤真菌多样性低于未处理土壤，接合菌门和球囊菌门数量增加，而担子菌门和变型菌门的丰度却有所降低（Jin，2010）；低温（250 ℃）和高温（650 ℃）条件下制备的生物炭都会降低土壤真菌多样性，但会使一些细菌和放线菌的相对丰度增加（Khodadad et al.，2011）；土壤灭菌和生物有机肥联用可使马铃薯根际土壤真菌群落多样性指数较对照显著下降5%～20%（刘星 等，2016）；通过翻耕连作马铃薯土壤30 cm和施用微生物菌剂，能够显著降低马铃薯耕层土壤真菌数量（谢奎忠 等，2013）；马铃薯随连作年限的延长，土壤真菌比例逐渐上升（孙权 等，2010）。本试验在土壤中添加不同量的生物炭，Chao1、Simpson指数和Shannon指数均呈下降趋势，其中T3处理的Chao1指数比对照降低41.1%；土壤真菌物种系统发育进化树表明，T3处理内外的红色覆盖区域最少，综合分析说明添加生物炭后，土壤真菌的丰富度或均匀度明显下降，其中T3处理真菌丰度偏低，与前人研究结果相符（孙权 等，2010；Jin，2010；谢奎忠 等，2013；刘星 等，2016）。但也有研究表明，采用RAPD分子标记技术检测，设施黄瓜轮作土壤的微生物群落均匀度、Shannon-Weaver 指数均比连作土壤高（吴凤芝和王学征，2007）；通过黑土长期定位施肥、采用q-PCR分析结果表明，施用无机肥会提高土壤中真菌的数量，施用有机肥则减少土壤中真菌数量，而有机无机肥配施的真菌数量与不施肥处理无显著差异（丁建莉 等，2017）。因此，有利的栽培措施能够直接影响关键菌群的消减，还是通过影响真菌多样性进而调控土壤养分循环，亟须进行深入分析。

本试验中，马铃薯根际土壤真菌群落主要有子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和球囊菌门，其中子囊菌门为优势种群，添加生物炭处理的丰度呈上升趋势，担子菌门和接合菌门则呈下降趋势。有报道指出担子菌中含有柄绣菌、黑粉菌等，能导致严重植物病害（李迅 等，2003）；子囊菌门丛赤壳科（Nectricaceae）菌多属于菌生真菌，可以寄生病原真菌，该类菌群数量的增加可能具有抑制病原真菌的功能（庄文颖，2010）。本试验中，土壤中添加生物炭后，担子菌门数量呈下降趋势，这可能会对植物生长有益；与对照相比，粪壳菌目Incertae sedis 23、小子囊菌科、毛壳菌科、丛赤壳科的丰度呈明显上升趋势，子囊菌科、粪壳菌科、粪壳菌目Incertae sedis的丰度呈明显下降趋势，与前人研究结果相似。有研究表明，生物炭的添加量为8 t·hm-2和20 t·hm-2时，玉米产量可提高71%和140%（Major et al.，2010）；生物炭的添加量为25.5～45.5 g·kg-1时，水稻生物量提高166%，果实产量提高294%，果实数量提高232%（Noguera et al.，2010）；生物炭的添加量为 10 t·hm-2时，小麦干质量可以提高66.7%（van Zwieten et al.，2010）；1 200 kg·hm-2炭基肥对马铃薯田土壤容重、孔隙度和养分含量影响最佳，可作为阴山北麓地区马铃薯种植的推荐施肥量（焦瑞枣 等，2015）。本试验中，每公顷添加20 t生物炭能够显著提高马铃薯单株产量、单株结薯数和商品薯率，分别比对照显著提高106.3%、58.6%、65.4%，和其他研究存在不同生物炭添加量的区别，可能是由于生物炭成分不同或土壤肥力不同，从而导致产量增幅不同。