乳酸菌代谢与食品风味物质的形成

马媛，耿伟涛，王金菊，王艳萍

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，被认为是普遍认定安全(generally recognized as safe)的菌株，有着悠久的应用历史，在食品工业中应用广泛[1]。乳酸菌利用五碳糖、六碳糖可以产生乳酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸，通过氨基酸代谢系统产生醋酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸，这些有机酸除本身呈味外，还能与醇类反应生成酯类，构成食品中的芳香成分[2]。在蛋白质代谢中，乳酸菌通过蛋白酶和肽酶的作用，产生大量的多肽和氨基酸；而在脂肪代谢中，乳酸菌通过代谢作用，降解发酵体系中的脂肪酸，同时产生酪酸、乙酸、丁酸、辛酸等短链脂肪酸；此外，乳酸菌本身代谢也能产生核酸、腺苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤等。因此，经过乳酸菌发酵的食品可以产生独特的风味。本文综述了乳酸菌四大代谢途径即糖代谢、蛋白质代谢、脂代谢及核酸代谢与风味物质之间可能的形成机制，以及当前乳酸菌在发酵调味品中的应用，为进一步研究乳酸菌发酵调味品提供了理论依据。

1 乳酸菌代谢风味物质形成的机制

1.1 乳酸菌糖代谢与风味物质的形成

乳酸菌能利用六碳糖、五碳糖，经过分解代谢产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，有些可直接作为风味物质或是重要风味物质的前体。在食品发酵过程中，乳酸菌同型发酵代谢糖类主要产生乳酸，异型发酵代谢产生乙醇及二氧化碳等发酵产物，也产生乙醛、丙酮、乙偶姻、双乙酰等多种挥发性芳香化合物，促进食品良好风味的形成[3]。葡萄糖经过己糖磷的酸化、磷酸己糖的裂解、氧化脱氢等糖酵解(EMP)步骤生成ATP及中间代谢产物丙酮酸，丙酮酸往往是后续反应的起点，最终释放出不同的香味和味觉活性化合物[4]，见图1。

图1 乳酸菌糖代谢形成风味物质的主要途径[5-8]

注：PO为丙酮酸氧化酶；AK为乙酸激酶；AAT为醇酰基转移酶；PFL为丙酮酸甲酸裂解酶；ALDH为乙醛脱氢酶；ADH 为醇脱氢酶；PTA为磷酸乙酰转移酶；ALS为乙酰乳酸合成酶；ALDC为乙酰乳酸脱羧酶；BDH为2,3-丁二醇脱氢酶；ALS为乙酰乳酸合成酶；DS为双乙酰合成酶；DR为双乙酰还原酶；PFL为丙酮酸甲酸裂解酶；PC为丙酮酸羧化酶；PDC为丙酮酸脱羧酶；CS为柠檬酸合成酶；SDH为琥珀酸脱氢酶；MDH为苹果酸脱氢酶；SCS为琥珀酰辅酶合成酶；OAD为草酰乙酸脱羧酶。

途径1：丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下直接还原成乳酸；

途径2：丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在双乙酰合酶的作用下生成双乙酰；

途径3：在 α-乙酰乳酸合成酶(ALS)的作用下生成 α-乙酰乳酸，可经氧化脱羧生成重要的食品风味物质——双乙酰；此外，α-乙酰乳酸还可以在α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)催化下生成另一重要的风味化合物——乙偶姻；乳酸菌能够在厌氧环境中代谢发酵谷物中的柠檬酸盐或丙酮酸盐，产生发酵产物乙偶姻和双乙酰(奶油香味)。

途径4：丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)的催化作用下转化成乙酰-CoA，继而在乙醛脱氢酶(ALDH)的作用下生成乙醛，乙醛在醇脱氢酶(ADH)的作用下生成乙醇。

途径5：葡萄糖先经过磷酸戊糖途径(HMP)生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛并释放二氧化碳，乙酰磷酸在乙酸激酶(AK)作用下产生终产物乙酸，3-磷酸甘油醛的终产物为乳酸。

途径6：丙酮酸脱羧形成的乙酰-CoA另外一条去路是与草酰乙酸在柠檬酸合酶催化下生成柠檬酸，进入三羧酸循环(TCA)，进而生成琥珀酸、苹果酸等有机酸。此外，草酰乙酸在草酰乙酸脱羧酶(OAD)的作用下经过脱羧反应生成丙酮酸，丙酮酸可进一步转化成乳酸。

Hansen A等的研究表明，面粉中乳酸菌发生乳酸发酵，产生的多糖以改善面团的粘度并产生风味化合物，乳酸菌发酵过程中将醛类(乙醛、2-甲硫基丙醛)代谢生成大量乙酸和2,3-丁二酮，发酵过程中3-甲基丁醛含量有所提高，改善了发酵酸面团的风味。杨浣漪等人以旧金山乳杆菌和酿酒酵母混合发酵酸面团，产生了新的风味物质乳酸异戊酯，改善了发酵面团的风味。Raquel Lo等[9]确定了鼠李糖乳杆菌发酵牛乳产生风味化合物的基础为乙酰乳酸合成酶基因(ais)，含有ais基因的乳酸菌发酵牛乳可产生大量双乙酰和乙偶姻，将含有ais的质粒导入缺陷型Lb.鼠李糖乳杆菌菌株LGG后，恢复了双乙酰和乙偶姻的产量。豉香型米酒醪发酵中，乳酸菌通过利用己糖、戊糖产生乳酸，乳酸在酵母酯化酶催化作用下与乙醇结合形成乳酸乙酯，即CH3CHOHCOOH+C2H5OH→CH3CHOHCOOC2H5+H2O，米酒经陈酿后乳酸、乳酸乙酯的含量有所增加。乳酸增加了米酒的微酸、涩，有浓厚感，使米酒口感醇厚，香气优雅[10]。本实验室利用乳酸菌发酵马铃薯，发酵后与发酵前相比，其风味物质的组成和含量均发生了较大的变化。经过发酵减少了刺激性风味物质成分所占总百分比，同时也产生了许多具有芳香的酮类和酯类等物质，改善了马铃薯乳酸菌饮料的风味，使之更加柔和。

1.2 乳酸菌蛋白质代谢与风味物质的形成

蛋白质与氨基酸的微生物分解代谢对于肉类、谷物等发酵食品风味化合物的形成具有重要作用，乳酸菌具有蛋白质的分解代谢及氨基酸代谢的酶系统，是食品风味物质形成的理论基础。发酵的食品中含有丰富的蛋白质，乳酸菌可以产生胞外蛋白酶将食物中的蛋白质水解成小分子的寡肽和氨基酸[11]。有些氨基酸本身呈味，如Leu，Ile和Val呈现出令人愉悦的麦芽味、水果味；Trp，Tyr和Phe呈现出花香味、排泄物味；Met，Cys呈现出熟透卷心菜味、大蒜味；Glu，Gly呈现出鲜味和酸味；Clu与发酵体系中的Na+结合成谷氨酸钠，鲜味作用更加明显，这些氨基酸本身丰富了发酵底物的风味。有些氨基酸是很多挥发性风味化合物的前体，可通过转运系统进入细胞参与氨基酸代谢，形成风味物质。

在乳酸菌的氨基酸代谢过程中，氨基酸主要通过4种代谢途径产生挥发性香气成分，见图2。

图2 乳酸菌蛋白质代谢形成风味物质的主要途径

注：KdcA为α-酮酸脱羧酶；AT为转氨酶；DH为α-酮酸脱氢酶；AAT为醇酰基转移酶；ES为酯酶；HA-DH为羟基酸脱氢酶；CR为化学反应；EC为苏氨酸醛缩酶；OX为氧化。

(1)氨基酸在转氨酶、裂解酶和脱氢酶等酶的作用下形成相应的α-酮酸，在α-酮酸脱羧酶(KdcA)作用下形成醛，醛有2种转化途径，其一由α-酮酸脱氢酶(DH)还原作用形成醇；其二由羟基酸脱氢酶(HA-DH)作用还原形成有机酸[12]。乳酸菌代谢产生的醇和有机酸在酯酶(ES)、醇酰基转移酶(AAT)的作用下形成相应的酯。芳香族氨基酸如苯丙氨酸在转氨酶的作用下产生苯丙酮酸和苯甲醛。苯丙酮酸可以代谢产生苯乳酸或苯乙醛，苯乙醛在脱氢酶的作用下产生苯乙醇，苯乙醇与乙酸结合形成乙酸苯酯。杨娟等[13]的研究表明贝莱斯芽孢杆菌和植物乳杆菌混合发酵豆豉中，支链氨基酸生物合成途径(一种关键风味物质通路)基因表达上调，5个参与3-羟基-2-丁酮利用基因中的4个也呈上调表达，说明2株菌混合发酵通过增强支链氨基酸和3-羟基-2-丁酮的代谢改善豆豉风味。(2)含硫氨基酸特别是甲硫氨酸在转氨酶(AT)的作用下生成2-酮-4-甲基硫代丁酸，可经化学反应直接形成甲硫醇，或者脱羧形成3-甲硫基丙醛再经化学反应形成甲硫醇，甲硫醇氧化形成具有洋葱或白菜气味的二甲基二硫化物或类似青菜气味的二甲基三硫化物[14]。Hanniffy S B等[15]从山羊干酪中分离出的乳酸球菌具有从L-甲硫氨酸形成挥发性硫化合物至关重要的酶——半胱氨酰亚砜裂解酶，可以将含硫氨基酸如L-甲硫氨酸、半胱氨酸转换为含硫化合物，增强奶酪的香气。(3)有些氨基酸如苏氨酸、赖氨酸不经转氨作用直接由酶催化形成风味物质。羟基氨基酸如苏氨酸在苏氨酸醛缩酶(EC属于一类裂解酶)作用下直接形成乙醛，乙醛具有果香清香味，是乳制品中的重要风味物质[16]。(4)通过还原氨基反应或转氨基作用，糖代谢途径中的一些代谢产物可生成相应的氨基酸。如丝氨酸可生成甘氨酸(甜味)、半胱氨酸，利用天冬氨酸可以合成赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸[17]。

1.3 乳酸菌脂代谢与风味物质的形成

酯类可以作为发酵微生物的碳源和能源，也是风味物质的重要源泉。在脂肪代谢过程中，脂(酯)酶发挥着重要作用。酯酶是双功能酶，既可以水解甘油三酯成脂肪酸，也可以催化醇和酯酰CoA(活化形式的脂肪酸)合成相应的酯。酯类在酯酶的作用下产生游离脂肪酸，脂肪酸可由4条代谢途径进一步被氧化产生短链脂肪酸、脂肪醛等风味物质，见图3。

图3 乳酸菌脂代谢形成风味物质的主要途径

注：LP为脂肪酶；HPL为氢过氧化物裂合酶；DH为脱氢酶；KADC为β-酮酯酰脱羧酶；AAT为醇酰基转移酶；ES为脂(酯)酶；OX为氧化；BOX为β-氧化。

途径1：脂(酯)酶作用于甘油三酯产生酯酰CoA，催化酯酰CoA与醇类形成酯，多数酯类呈水果和花香味，可降低由脂肪酸和胺类产生的苦味和其他异味。

途径2：不饱和脂肪酸在自由基存在下被氧化形成氢过氧化物，其迅速分解形成己醛或不饱和醛。

途径3：饱和脂肪酸通过 β-氧化降解为乙酰CoA，经乙酰CoA 这个代谢枢纽进入糖和氨基酸代谢，最终氧化分解生成烃类、醛类、醇类、酮类等芳香族化合物。

途径4：游离脂肪酸通过 β-氧化也导致4-或5-羟基酸的形成，其容易通过 β-酮酸的脱羧而环化成 γ-或 δ-内酯。乳酸和乙酸是乳酸发酵的主要有机酸，可分别参与乳酸乙酯和乙酸乙酯的酯化反应。

Sita Ramyasree Uppada等[18]的研究表明，植物乳杆菌(MTCC 4461)可用作脂肪酶的来源，其代谢产生的脂肪酶用于肉类降解和酯化反应，在脂肪酶催化作用下，合成不同的短链脂肪酸酯如2,3,4-羟基苄基乙酸酯和三唑酯。72 h可将脂肪彻底水解，并产生强烈的气味和泡沫，这可能是由于脂肪酸自动氧化成短链醛或酮，导致有异味和泡沫。Zhao等[19]的研究结果表明保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)能有效地将生猪肉发酵成猪肉干。在发酵过程中，产生一些能够影响肉味的重要化合物，包括1-辛烯-3-醇、苯甲醛、戊醛、辛醛、壬醛和2-戊基呋喃，有效地改善了生猪肉干燥的质地和风味。Ripan等[20]利用植物乳杆菌(NRRL-B 4496)和植物乳杆菌(NCDO 1193)发酵黄花扁豆过程中发现乙酸和丁酸的浓度明显增加，说明这2株菌可以有效地代谢脂肪酸产生短链脂肪酸。其他酸如己酸、辛酸和癸酸是源自脂质降解或碳水化合物代谢的脂肪酸。综上，乳酸菌可以分解脂类物质为游离脂肪酸，并进一步代谢形成了各种不同的风味物质。

1.4 乳酸菌核酸代谢与风味物质的形成

次黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)作为调味组分被广泛用作食品调味添加组分。在含乳酸菌的发酵体系中，呈味核苷酸的来源有2种：一为乳酸菌、酵母菌等微生物的RNA降解获得，二为乳酸菌本身的核酸代谢产生。乳酸菌核酸代谢有2种途径：一为从头合成途径，即利用5-磷酸核糖、氨基酸、一碳单位和CO2等简单物质为原料，经过一系列的酶促反应合成核苷酸。第一步反应，磷酸戊糖途径中产生的磷酸戊糖活化为5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)，谷氨酰胺提供酰胺基取代5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)C1焦磷酸基，形成5-磷酸核糖胺(PRA)，催化此反应的酶为谷氨酰胺磷酸核糖酰胺转移酶，此酶是一种别构酶，是调节嘌呤核苷酸合成的重要酶。第二步反应形成五元咪唑环，即5-氨基咪唑核苷酸(AIR)。第三步反应为AIR羧基化形成5-氨基咪唑-4-羧酸(CAIR)、CAIR与天冬氨酸在合成酶的作用下形成甲酰胺核苷酸(SAICAR)，SAICAR在裂解酶作用下脱去延胡索酸形成5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)，由N10-甲酰四氢叶酸提供甲酰基，在转氨酶作用下形成5-甲酰氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸，最后脱水环化形成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，在IMP的基础上形成腺嘌呤核苷酸(AMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)。二为补救合成途径，有些乳酸菌为嘌呤和嘧啶营养缺陷型菌株，利用补救途径将所需的核苷碱基或核苷转化为核苷酸。如乳酸乳球菌不能直接磷酸化嘌呤核糖核苷而依赖于嘌呤补救中碱基的磷酸核糖基化，因此，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)为乳酸乳球菌嘌呤从头合成基因表达的诱导物，嘌呤碱如次黄嘌呤或鸟嘌呤与PRPP在活性较高的次黄嘌呤-鸟嘌呤核酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT)作用下合成次黄嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(GMP)[21]，见图4。 韩国传统酱料(酱油、红辣椒酱、豆酱)加猪肉自然发酵28天，游离氨基酸随着发酵时间增加而增加，5'-IMP的含量随着发酵时间延长减少，肌苷含量随发酵时间延长而增加，氨基酸含量的变化改善了猪肉的香气、风味、柔嫩和多汁性。

图4 乳酸菌核酸代谢形成风味物质的主要途径

2 乳酸菌代谢风味在调味品中的应用

乳酸菌在发酵调味料中的呈味作用主要体现在香、味2个方面，除发酵底物本身存在挥发性风味物质和呈味物质外，乳酸菌的代谢产物可以有效改善发酵底物的原有品质，主要是改善香和味2个方面：

2.1 香

Risa Harada等[22]的研究表明乳酸菌在酱油发酵中发挥着重要作用，产生的乳酸影响酱油的风味，如一种关键的芳香族化合物2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮的形成受乳酸和醋酸含量影响。徐俐等[23]利用嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和植物乳杆菌(L.plantarum)发酵番茄、辣椒、姜、大蒜混合酸汤，发酵酸汤中检测到风味物质醇20种、酸6种、酯17种、醛5种、酮2种、烯29种、含硫化合物1种、烷烃4种、其他化合物6种，9类风味成分，2种菌混合处理组总挥发物含量最高，为 96.273%，从而获得以酸味为主，口感独特的酸汤调味料。游刚等[24]以复合乳酸菌发酵腌制六尺金线鱼肉，检测出腌制鱼肉与发酵鱼肉独特风味的主要成分是醛、醇、酮类化合物，复合乳酸菌发酵鱼肉的醛、醇、酮类化合物种类总量达41种，较传统高盐腌制鱼肉增加16种。其中，(E)-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、(Z)-4-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、十四醛、庚醇、2-乙基-1-己醇、十二醇、6-甲基-2-庚酮、3,5-壬二烯-2-壬酮、D-柠檬烯、长叶烯是发酵鱼肉特有风味成分，丰富了发酵鱼肉风味，改善了鱼肉品质。乳酸菌发酵接骨木果汁后检测到82种不同种类的挥发性化合物，包括醇类、萜烯类、降异戊二烯类、有机酸、酮类和酯类等，乳酸菌L.plantarum285发酵果汁总挥发性化合物的浓度最高，酮在发酵和贮藏后均有所增加，最明显的是乙酸乙酯和双乙酰。2-苯基甲醇、2-苯乙醇和异戊醇是由乳酸菌的氨基酸的分解代谢产生的，特别是异戊醇的产生与乳酸细菌对亮氨酸的分解代谢有关。发酵后果汁中主要的酯类，如乙酸乙酯、异戊酸甲酯、异戊酸异戊酯、水杨酸甲酯，特别是异戊基异戊酸(苹果味)，可能是由异戊醇和异戊酸酯化合成的。

2.2 味

费永涛等[25]的实验结果显示乳杆菌属是酸浆水中的主要微生物并促进酸浆水中化学物质变化，以酸浆水点浆制成的豆腐微酸、鲜嫩、口感好，无石膏、卤水等化学原料点制豆制品的那种苦涩味道，草酸、DL-酒石酸、丙酮酸、苹果酸、a-酮戊二酸、乳酸、乙酸、马来酸、柠檬酸和富马酸，这些有机酸是发酵过程中各种生化过程的中间产物和代谢物，丰富了发酵体系的风味。在传统鱼露发酵中乳酸菌和酵母菌是发酵鱼露的优势菌，两者代谢影响发酵过程中游离氨基酸的动态变化。发酵鱼露营养成分包括必需氨基酸、生物活性肽和有机酸等，产品滋味成分主要包括鲜味、酸味、苦味和咸味等[26]。段旭昌等[27]利用乳酸菌发酵甲鱼酶解液，发酵前后游离氨基酸含量发生明显变化，总游离氨基酸含量由原来的503 mg/kg减少到346 mg/kg, 减少近1/3，尤其是苦味的Asp，Cys，Val，Ile，Lys，Arg在发酵前后减少较多。而微苦味的Phe和甜味的Ala有略微的增加，其余所有的苦味氨基酸经发酵后都有所减少。通过乳酸菌发酵使苦味氨基酸转化，使甲鱼酶解液整体风味得到改善，并具有特殊的发酵香气。赵华杰等[28]利用乳酸菌发酵贻贝蒸煮液制备调味料，获得浓度为0.74 g/dL的氨基酸态氮，游离氨基酸含量丰富，经乳酸菌发酵获得的有机酸有焦谷氨酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丙酸，而乳酸是一种酸味柔和的调味剂，与苹果酸、柠檬酸等有机酸共同作用形成酸味丰满的口感。后立琼等[29]以大米、糯米、鲜嫩玉米为原料，人工接种苗族农家老酸汤生产谷物类发酵型白酸汤，经乳酸菌发酵后呈现出酸爽适口，质地细腻、柔和爽口的感官特征。

综上所述，乳酸菌可以利用糖类、蛋白质、有机酸、氨基酸等各类营养物质产生挥发性和非挥发性风味物质，改进食品或调味品的风味，以减轻豆类、乳类、禽肉、鱼肉类等原料的异臭味，改善食品的风味。

3 展望

我国调味品的研制及食用有着非常久远的历史，随着人们饮食结构的改变，调味品的种类越来越多。近年来，传统调味品行业经历了显著的变革，注重调味品风味的同时，消费者更为关注调味品中的有益成分。而乳酸菌发酵产生的产物是对人体有积极作用的新型生物活性物质，如能够抵抗癌症和肿瘤，同时还能预防血栓、肥胖、糖尿病和便秘。因此，微生物发酵法的应用越来越成为健康生产方式的发展趋势。目前，对发酵食品风味物质的研究主要集中在以下3个方面：(1)发酵食品风味形成过程中关键微生物的发现；(2)探讨改进发酵工艺，提高食品风味的可能性；(3)不同发酵食品风味物质的呈味及相互作用。而当前的工作对以上3个方面研究仍然缺乏系统性，对于发酵机理、新陈代谢规律、生理活性成分、风味物质形成机制等有待深入研究和应用。另外，基于乳酸菌的代谢机制，对于发酵调味品的呈味也可从以下3个方面入手：(1)选择复合的发酵底物(如植物蛋白源、动物蛋白源、果蔬类复合发酵)；(2)多菌种合作共酵；(3)从菌中筛选与风味形成相关的候选基因，进一步研究改善风味的分子机制。希望根据乳酸菌的新陈代谢机制开发出具有丰富营养价值和独特鲜美风味的天然性发酵调味料。