实验性鼻窦炎嗅黏膜形态学与ATP酶变化的研究

王 斌，李 勇， 曹晓林， 金卫东， 刘 锋

(1. 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科，浙江 杭州 310006；2.海军军医大学附属长海医院 耳鼻咽喉头颈外科，上海 200433)

引起人类嗅觉障碍的病因大致包括鼻腔、气道的机械性阻塞、损伤，细菌、病毒感染，营养及代谢因素，医源性及内分泌性因素等。研究发现[1]，上呼吸道的感染、鼻腔炎和鼻窦炎性疾病是引发功能嗅觉障碍的最常见原因。鼻-鼻窦炎经常反复可引起部分患者嗅觉减退或丧失。何建平等[2]通过急性鼻-鼻窦炎致嗅觉障碍大鼠模型观察炎症不同时期嗅黏膜微结构的变化情况，显示嗅黏膜纤毛-嗅神经结构和功能受损可导致嗅觉障碍。王彤等[3]研究发现，部分鼻-鼻窦炎性疾病患者通过手术重建鼻腔的生理功能，可改善和恢复鼻腔的通气、鼻窦黏膜的形态和生理功能。周兵等[4]研究发现，行手术治疗的56例儿童慢性鼻窦炎患者中，60.7%的患者嗅功能改善或恢复。ATP酶参与维系纤毛正常功能的动力和维持嗅觉信号转导过程中的离子电势能状态。本研究探讨新西兰大白兔鼻窦炎模型中，嗅黏膜形态学及嗅黏膜中Na+-K+-ATP酶表达的变化。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 选用新西兰大白兔50只，雄性，体重2.5～3.5 kg，排除鼻腔和上呼吸道疾患，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，使用许可证号： SYXK(浙)2018-0012。以动物每侧鼻窦为一个单位随机分为三组，正常对照组20侧鼻窦，不予任何处理；鼻窦炎组和手术处理组各40侧鼻窦， 建立鼻窦炎动物模型。手术处理组在建模4周时，在鼻内镜引导下，适当扩大上颌窦窦口；术后予以1%呋喃西林滴鼻液滴鼻，1天3次，每侧3滴/次，共用7天。

1.2 鼻窦炎动物模型的制备[5]鼻窦炎组和手术处理组兔子分别称重、固定，20%乌拉坦按5 mL/kg剂量静脉注射。麻醉成功后，常规术区准备消毒铺巾，鼻背旁约1 cm处，鼻内镜引导下，于上颌窦前壁开窗，直径约3 mm，取周围组织将窦口完全封闭，采用可吸收缝线缝合切口。将标准肺炎链球菌制成浓度为1个麦氏单位的培养菌，培养液为0.45%氯化钠溶液。术后第二天，将1 mL肺炎链球菌液经上颌窦开窗处注入窦腔内，术后切口处涂红霉素软膏5 d。

1.3 鼻窦炎动物模型的鉴定 制模2周，切开上颌窦前壁，内窥镜下观察窦腔内黏膜有不同程度的充血、肿胀，窦口封闭完好，分泌物细菌培养为肺炎链球菌阳性；制模4周， CT影像学检查见鼻窦黏膜增厚，窦腔密度增高为建模成功。

1.4 嗅黏膜常规病理检查 全麻、断头处死动物，自鼻背部中线纵行切开，暴露鼻腔，取嗅区黏膜于福尔马林液中固定，行HE染色后进行常规病理学检查。

1.5 嗅黏膜扫描电镜观察 取嗅区黏膜于4%多聚甲醛固定4 h以上后，用0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次10 min。再用1%的锇酸(用0.2 mmol/L PBS配置)固定2 h后，0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次10 min。系列乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)各15 min脱水，标本临界点干燥(日立HCP-2型)，用醋酸异戊酯过渡15 min，CO2临界点干燥3 h以上，最后离子镀膜(EIKO.IB-5)10 min，采用日立S-520扫描电镜观察。

1.6 嗅黏膜透射电镜观察 取嗅区黏膜用0.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液固定4 h后微波5 s。采用0.1mol/L二甲砷酸钠洗液漂洗4 h或过夜。用1%锇酸固定，酒精逐级脱水后采用EMbed 812包埋试剂盒包埋，采用德国Leica EM UC6超薄切片机超薄切片，铀铅双重染色后用H-800透射电镜(日本日立公司)观察。

1.7 嗅黏膜Na+-K+-ATP酶透射电镜观察 采用细胞化学方法定位和半定量观察透射电镜下嗅黏膜纤毛中的ATP酶变化。取嗅区黏膜用0.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液固定25 min后微波5 s。采用0.1 mol/L二甲砷酸钠洗液漂洗4 h后，用0.2 mol/L Tris(pH 9.0)洗3次，每次30 min。用去底物的培养液(0.2 mol/L Tris 10 mL，0.2 mol/L氯化锶 2 mL，0.2 mol/L氯化钾 1 mL，0.05 mol/L氯化镁4 mL，对硝基苯磷酸钠34 mg，双蒸水3 mL ，pH 9.0)37 ℃预孵育30 min。蒸馏水洗2次后，采用0.05 mol/L Tris洗30 min。蒸馏水洗2次后，2%硝酸铅孵育15 min。蒸馏水洗3次后，4%多聚甲醛固定2 h。用0.2 mol/L Tris漂洗后，1%锇酸固定、脱水、采用Epome812包埋试剂盒包埋，采用德国Leica EM UC6超薄切片机切片，铀铅双重染色后用H-800透射电镜(日本日立公司)观察。

1.8 嗅黏膜ATP酶含量检测 取嗅区黏膜用生理盐水漂洗3遍，拭干，称重。剪碎后加适量预冷生理盐水于玻璃匀浆管中匀浆， 4000 r/min 离心10 min，取上清100 μL。采用ATP酶测试盒(南京建成生物工程研究所)，根据说明书进行ATP酶测量。

1.9 统计学方法 采用SPSS统计软件，计量资料比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下嗅黏膜形态学病理变化 200倍光学显微镜下见正常对照组的嗅黏膜：游离缘为纤毛，上皮层由支持细胞、嗅感受神经元和基底细胞构成。支持细胞多呈单排排列，其核多为椭圆形状；嗅感受神经元是梭形双极细胞，核多呈椭圆形、梭形；基底细胞形状多形，可见多种形态的胞核，见封三图1A。鼻窦炎组建模4周的嗅黏膜：纤毛融合、脱落进一步加重，上皮细胞层结构紊乱、破坏，但基底细胞层完整。淋巴、单核细胞浸润，嗅神经元凋亡，固有层腺体减少，见封三图1B。鼻窦炎组建模8周的嗅黏膜：纤毛完全脱落，上皮细胞仅剩基底细胞层。淋巴、单核细胞浸润，纤维组织增生，固有层腺体被进一步破坏，见封三图1C。手术处理组术后8周的嗅黏膜：纤毛再生已接近正常，上皮细胞层结构也趋正常，固有层腺体再生明显，纤维组织减少，见封三图1D。

2.2 扫描电镜下嗅黏膜形态学变化 正常嗅黏膜：黏膜上皮完整连续，纤毛排列整齐、致密，粗细均匀，长短一致，见封三图2A。鼻窦炎组建模8周的嗅黏膜：部分纤毛上皮细胞剥脱、坏死，细胞间隙增宽，纤毛完全脱落，鳞状上皮化生，见封三图2B。

2.3 透射电镜下嗅黏膜形态学变化 正常对照组嗅上皮纵切面可见排列整齐的上皮细胞、表面的嗅纤毛、膨大的嗅囊，游离缘尚可见支持细胞的微绒毛；细胞内可见大量的各种细胞器，见封三图3A；横切面微管排列规整，成典型的“9+2”结构，见封三图3B；Na+-K+-ATP酶透射电镜下，沿细胞膜分布着大量Na+-K+-ATP颗粒，核膜处颗粒不明显，见封三图3C；但部分分泌细胞核膜处可见大量黑色颗粒沉积。鼻窦炎组嗅黏膜细胞表面嗅纤毛大量脱落，有短纤毛出现；部分支持细胞微绒毛消失，电子致密的囊泡明显减少，出现大量的空泡，见封三图3D；Na+-K+-ATP酶透射电镜下，细胞表面嗅纤毛无黑色颗粒沉积，细胞内线粒体减少、核膜处见黑色颗粒沉积，见封三图3E。手术处理组术后8周的嗅黏膜上皮细胞纵切面嗅纤毛及微绒毛增加，胞浆内线粒体增加，空泡减少，见封三图3F；横切面纤毛及微绒毛增加，纤毛排列整齐，粗细均匀，见封三图3G；Na+-K+-ATP酶透射电镜下，沿细胞膜分布着大量Na+-K+-ATP颗粒，见封三图3H。

2.4 嗅黏膜ATP酶含量 手术处理组的ATP酶含量(0.229±0.100 μmolPi/mg)与鼻窦炎组(0.124±0.033 μmolPi/mg)比较，差异有统计学意义(t=3.884,P=0.006)；正常对照组的ATP酶含量(0.248±0.082 μmolPi/mg)与手术处理组比较，差异无统计学意义(t=-0.306,P=0.642)。

3 讨论

杨丽辉等[6]研究发现，随着鼻窦炎症的发展，呼吸上皮范围扩大、嗅上皮的面积减少，进而导致嗅觉下降；嗅上皮嗅细胞减少、嗅上皮萎缩是嗅觉障碍的病理学基础。Mulvaney等[7]研究测量兔嗅上皮面积约为7.27～9.3 cm2，每平方厘米嗅上皮大约有1千万个嗅神经元。嗅神经元是双极细胞，具有再生能力，修复周期约30 d。嗅觉受体为G蛋白偶联受体[8-10]，嗅觉信号与嗅觉受体结合后，经过一系列的转化和信号传递，产生动作电位并传导到大脑嗅觉中枢；静息时流动的离子泵回原位，恢复嗅觉受体的膜电位水平，这些过程需要Na+-K+-ATP酶参与[11-12]。ATP酶活力的大小是细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标[13]。

本研究结果显示，炎症状态的嗅黏膜表面嗅纤毛大量脱落，细胞内线粒体减少、肿胀、出现空泡，嗅黏膜中Na+-K+-ATP酶的含量明显减少；随着炎症的改善，嗅粘膜Na+-K+-ATP酶含量恢复接近正常对照。原因可能为：①炎症状态时，鼻黏膜肿胀、分泌物潴留使气流难以到达嗅区，同时嗅纤毛脱落、嗅觉受体减少而导致嗅觉减退甚至丧失；②ATP酶表达减少、细胞内线粒体减少而使产生的ATP下降，从而不能充分提供嗅觉信号转导过程中的能量，同时导致利用ATP生产的第二信使cAMP减少，激活离子门控通道的能力下降，影响动作电位的形成，导致嗅觉信号传导而引起嗅觉障碍；③Na+-K+-ATP酶减少影响静息时流动的离子泵回原位，进而阻碍动作电位的产生，导致嗅觉信号传导障碍。提示炎症状态使嗅粘膜中Na+-K+-ATP酶的表达降低可能是导致嗅觉障碍发生的原因之一，但其具体机制有待进一步研究。

内窥镜鼻窦手术术后嗅觉的恢复主要得益于再生的嗅上皮和气流动力学的改善。但术后嗅觉恢复程度与嗅上皮病变程度成正相关，嗅细胞的数量减少越明显，嗅觉障碍治疗的预后越差[14]。Downey等[15]评价了50例与鼻窦炎有关的嗅觉障碍患者行鼻内镜手术后嗅觉的变化，结果显示，手术治疗后52%患者的嗅觉获得了有意义的改善，且改善率随术后时间的延长而提高。Lund等[16]评价了200例慢性鼻窦炎患者行鼻窦内窥镜手术后的效果，发现术后主观嗅阈、客观评分和视觉分类值均明显改善。国内外文献[17-19]也有慢性鼻窦炎患者经鼻内镜手术后嗅觉恢复存在差异的报道，可能与鼻窦炎的分型、病史长短、嗅黏膜损伤程度、手术方式及个体差异等有关。另本研究结果提示，鼻窦炎引起嗅觉下降的患者尽早手术有利于嗅黏膜及嗅觉的恢复。