脉冲染料激光调节TGF-β1/Smad3信号通路促进成纤维细胞凋亡改善瘢痕增生的机制研究

熊维 彭曦 黄海艳

【摘要】 目的：观察脉冲染料激光（PDL）对增生性瘢痕的预防及治疗的有效性，比较治疗前后的瘢痕组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3基因的表达情况，探讨PDL治疗增生性瘢痕的机制。方法：以兔耳增生性瘢痕模型为研究对象，检查上皮化后和增生性瘢痕形成后PDL治疗对瘢痕的瘢痕增生指数（SEI）、瘢痕内成纤维细胞密度、胶原纤维面积、细胞凋亡、胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值以及TGF-β1、Smad3表达的改变情况。结果：上皮化后创面接受PDL治疗后，SEI、成纤维密度指标、胶原纤维面积均保持平稳低水平（P>0.05）;细胞凋亡率随天数增加明显上升（P<0.05）;胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值、TGF-β1、Smad3表达均无明显改变（P>0.05）。瘢痕形成后接受PDL治疗，SEI、成纤维密度指标、胶原纤维面积、胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值、TGF-β1、Smad3表达随天数增加均呈下降趋势（P<0.05）;细胞凋亡率随天数增加明显上升（P<0.05）。结论：PDL治疗通过下调TGF-β1/Smad3信号通路表达，促进瘢痕内成纤维细胞凋亡，从而预防及改善瘢痕增生。

【关键词】 增生性瘢痕 脉冲染料激光 转化生长因子-β1

[Abstract] Objective： To observe the effectiveness of pulsed dye laser （PDL） in the prevention and treatment of hypertrophic scar， compare the expression of transformed growth factor-β1 （TGF-β1） and Smad3 genes in scar tissue before and after treatment， and explore the mechanism of PDL in the treatment of hypertrophic scar. Method： The rabbit ear hypertrophic scar model was studied， check after the epithelium and hyperplastic scar formation after PDL to treat the scar of scar elevation index （SEI）， fibroblast density in scar， collagen fiber area， cell apoptosis， and collagen Ⅰ/Ⅲ ratio and TGF-β1， Smad3 expression change. Result： After PDL treatment， SEI， fibroblast density index and collagen fiber area remained stable and low （P>0.05）， apoptosis rate increased significantly with the number of days （P<0.05）， and there were no significant change in collagen Ⅰ/Ⅲ ratio， TGF-β1 and Smad3 expression （P>0.05）. After receiving PDL treatment after scar formation， SEI， fibroblast density index， collagen fiber area， collagen Ⅰ/Ⅲ ratio， TGF-β1 and Smad3 expression showed a decreasing trend with the number of days （P<0.05）， and apoptosis rate increased significantly with the number of days （P<0.05）. Conclusion： Pulsed dye laser therapy can down-regulate the expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway and promote the apoptosis of fibroblasts in scar， thereby preventing and improving scar hyperplasia.

[Key words] Hypertrophic scars Pulsed dye laser Translation growth factor β 1

First-authors address： Peking University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.35.006

增生性瘢痕是一種影响器官功能、美观、心理健康、生活社交的疾病。其产生与多种因素有关，治疗方法多样，疗效不一[1-2]。目前瘢痕的发病机制不明确、治疗手段多样但效果均有限，是皮肤科及整形科的难题之一。探究其发病原因和机制，寻求理想的防治方法是目前基础研究和临床实践中的紧迫课题。近年来，国内外报道了多种激光设备对增生性瘢痕具有良好的疗效，而最常见的激光设备是脉冲染料激光（PDL）[3-4]。因此，本研究以兔耳增生性瘢痕模型为研究对象，观察PDL对增生性瘢痕的预防及治疗的有效性，比较治疗前后的瘢痕组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad3基因的表达情况，探讨PDL治疗增生性瘢痕的机制。

1 材料与方法

1.1 兔耳瘢痕造模与分组 参考文献[5-6]的方法，构建兔耳增生性瘢痕模型，简单叙述如下：2019年2-6月选取20只新西兰大耳兔，兔龄2～3个月，性别不限，体重1.5～2.0 kg，采用氯胺酮肌注麻醉后，在兔双耳腹侧各做4处直径为1 cm的全层皮肤及软骨膜缺损切口，切口之间间距2 cm以上，共计160个切口。术后予以常规自然愈合，正常饲养。待术后2周，所有创面愈合（即上皮化）后，随机选取10只入上皮化实验;剩余10只待术后3周瘢痕形成，入瘢痕实验。上皮化实验分为对照1组（CON-1组）和PDL-1组，瘢痕实验分为对照2组（CON-2组）和PDL-2组。两实验各自的组间比较采用同一只实验兔左右耳自身对照，即CON-1组：n=10，PDL-1组：n=10，CON-2组：n=10，PDL-2组：n=10。

1.2 治疗方案与取材 PDL治疗参数设置如下：能量5.5～8.5 J/cm2;脉宽0.5～2.0 ms;频率1 Hz;光斑5～7 mm。PDL-1组创面处与PDL-2组增生瘢痕处分别接受2次PDL治疗，2次治疗之间间隔2周。关于取材方案，在上皮化实验中，在上皮化后PDL治疗前和上皮化后2周（第14天）、4周（第28天）分别切取两组增生性瘢痕，共计取材120处，其中60处用于组织学分析，60处用于RNA和蛋白表达分析。瘢痕实验取材方案与上皮化实验相同。

1.3 观察指标 （1）瘢痕增生指数（scar elevation index，SEI）：计算公式为SEI=（瘢痕厚度-正常兔耳厚度）/正常兔耳厚度;当SEI>1.6，认为存在明显瘢痕，提示瘢痕增生模型成功。（2）瘢痕内成纤维细胞密度：采用HE染色法对瘢痕进行细胞学分析，按照HE染色试剂盒（武汉谷歌生物科技公司，G1005）步骤操作。在普通光学显微镜下观察瘢痕块的组织结构和成纤维分布，计算成纤维细胞密度，具体方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件计算出视野内成纤维细胞数目，求出与视野面积的比值，并算出5个视野的平均成纤维细胞密度值。（3）胶原纤维面积百分比：采用Masson染色法对瘢痕进行胶原纤维形成情况分析，按照Masson染色试剂盒（Servicebio，G1006）步骤操作。在普通光学显微镜下观察瘢痕块的胶原纤维形成和分布，计算胶原纤维面积百分比，具体方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件计算出视野内蓝染的胶原纤维面积，求出该面积与组织总面积的比值，即胶原纤维面积百分比，并算出5个视野的平均胶原纤维面积百分比。（4）细胞凋亡率：采用TUNEL法评估瘢痕组织内细胞凋亡情况，按照TUNEL染色试劑盒（罗氏，11684817910）步骤操作。凋亡细胞的细胞核呈现淡棕色至深棕黄色颗粒。高倍镜下，每张切片随机选取3个阳性细胞最多的视野进行计数，计算凋亡细胞率（凋亡细胞数/总细胞数），取3个视野的均数。（5）Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白比值：采用western blot法，检测瘢痕组织中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的含量，采用灰度值法计算两者含量的比值。（6）TGF-β1、Smad3基因的mRNA表达水平：提取瘢痕组织内的总RNA，采用RT-PCR方法，进行40个循环扩增，GAPDH为内参基因，采用靶基因量=2-??Ct公式计算TGF-β1、Smad3基因mRNA水平，采用比较Ct值方法以内参相对定量靶基因表达水平。引物设计如下：TGF-β1：（F）5‘-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3，（R）5‘-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3;Smad3：（F）5‘-CAGCGACCACCAGATGAAC-3，（R）5‘-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3;GAPDH：（F）5‘-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3，（R）5‘-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，计量资料采用（x±s）表示，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用One-Way ANOVA分析;计量资料以率（%）表示，比较采用字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔耳瘢痕增生指数变化情况 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内SEI随着天数增加而呈上升趋势（P<0.05），而PDL-1组SEI保持平稳低水平，未出现明显上升（P>0.05）;此外，术后第14、28天，PDL-1组的SEI均较相同时间点的CON-1组显著下降（P<0.05）。见表1。在瘢痕实验部分，CON-2组瘢痕组织内SEI随着天数增加维持平高水平（P>0.05），而PDL-2组SEI随天数增加呈现下降趋势（P<0.05）;此外，术后第14、28天，PDL-2组的SEI均较相同时间点的CON-2组显著下降（P<0.05）。见表2。

2.2 瘢痕内成纤维密度变化情况 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内成纤维密度指标随着天数增加而呈上升趋势（P<0.01），而PDL-1组成纤维密度指标保持平稳水平，未出现明显上升（P>0.05）;此外，术后第14、28天，PDL-2组的成纤维密度指标均较相同时间点的CON-1组显著下降（P<0.05）。见表3。在瘢痕实验部分，CON-2组瘢痕组织内成纤维密度指标随着天数增加保持平稳水平（P>0.05），而PDL-2组成纤维密度指标随天数增加呈现下降趋势（P<0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-2组的成纤维密度指均较相同时间点的CON-2组显著下降（P<0.05）。见表4。

2.3 瘢痕内胶原纤维面积变化情况 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内胶原纤维面积百分比随着天数增加而呈上升趋势（P<0.01），而PDL-1组胶原纤维面积保持平稳水平，未出现明显上升（P>0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-1组的胶原纤维面积百分比均较相同时间点的CON-1组显著下降（P<0.05）。见表5。在瘢痕实验部分，CON-2组瘢痕组织内胶原纤维面积百分比随着天数增加保持平稳水平（P>0.05），而PDL-2组胶原纤维面积百分比随天数增加呈现下降趋势（P<0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-2组的胶原纤维面积百分比均较相同时间点的对照组显著下降（P<0.05）。见表6。

2.4 瘢痕内细胞凋亡检测结果 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内细胞凋亡率随着天数增加无明显变化（P>0.05），而PDL-1组细胞凋亡率随天数增加明显上升（P<0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-1组的细胞凋亡率均较相同时间点的CON-1组显著上升（P<0.05）。见表7。在瘢痕實验部分，CON-2组瘢痕组织内细胞凋亡率随着天数增加无明显变化（P>0.05），而PDL-2组细胞凋亡率随天数增加明显上升（P<0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-2组的细胞凋亡率均较相同时间点的CON-2组显著上升（P<0.05）。见表8。

2.5 瘢痕组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达情况 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值随天数增加逐渐上升（P<0.05），而PDL-1组胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值随天数增加无明显改变（P>0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-1组的Ⅰ/Ⅲ比值较相同时间点的CON-1组均显著下降（P<0.05）。在瘢痕实验部分，PDL-2组胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值随天数增加明显下降（P<0.05）;而CON-2组胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值随天数增加无明显改变（P>0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-2组的Ⅰ/Ⅲ比值较相同时间点的CON-2组均显著下降（P<0.05）。见图1和表9、10。

2.6 TGF-β1、Smad3的mRNA表达情况 在上皮化实验部分，CON-1组瘢痕组织内TGF-β1、Smad3的mRNA表达随天数增加均逐渐上升（P<0.05），而PDL-1组TGF-β1、Smad3表达随天数增加均无明显改变（P>0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-1组的TGF-β1、Smad3表达较相同时间点的CON-1组均显著下降（P<0.05）。见表11。在瘢痕实验部分，PDL-2组TGF-β1、Smad3表达随天数增加均明显下降（P<0.05）;而CON-2组TGF-β1、Smad3表达随天数增加均无明显改变（P>0.05）;此外，术后第14、28天时，PDL-2组的TGF-β1、Smad3表达较相同时间点的CON-2组均显著下降（P<0.05）。见表12。

3 讨论

瘢痕是人体组织创伤修复过程中不可避免的产物，但瘢痕组织的外观或功能严重影响患者的身心健康和生活质量。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前已成为世界性的问题[7-8]。随着激光技术的发展，多种激光设备都被尝试着用于治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。目前，已有大量的报道包括动物实验及临床研究证实，多种激光设备对增生性瘢痕有治疗作用。PDL 585 nm是针对血管治疗的激光，以抑制瘢痕血管为主[9-11]。Kuo等[12]研究证实，PDL可减少TGF-β的表达，从而抑制成纤维细胞的增殖与分裂，减少胶原沉积。朱玉等[13]验证不同治疗周期PDL照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的增殖过程，诱导细胞凋亡，且1周治疗组与2周治疗组两组无明显差异。在临床研究中，McCraw等[14]应用PDL 585 nm激光治疗创口瘢痕后，瘢痕快速变软，红色消退，更接近正常肤色，取得了良好的疗效。同样Liew等[15]应用PDL 585 nm激光于深度伤创面上，每3周1次，可有效预防增生性瘢痕，且无明显副作用。本研究以兔耳增生性瘢痕模型为对象，探索了PDL对增生性瘢痕的预防及治疗效果，明确上皮化后的创面早期接受PDL治疗，可抑制其向增生性瘢痕转化;当瘢痕形成后接受PDL治疗，可有效改善瘢痕增生程度。

TGF-β是目前公认的与创伤密切相关的细胞因子之一，也是与瘢痕疙瘩形成密切相关的最具代表性的细胞因子，其异常表达会促进病理性瘢痕的形成[16-17]。TGF-β1高表达可刺激大量成纤维细胞增殖和合成胶原、弹力蛋白、纤维结合蛋白、粘蛋白等ECM成分，同时抑制胶原降解，使胶原的合成和降解不平衡[18]。TGF-β1分泌后与受体连接，激活信号转导通路，其中Smad信号通路是研究最多的信号传导途径[19-20]。本研究结果推测，PDL治疗通过下调TGF-β1/Smad3信号通路表达，促进瘢痕内成纤维细胞凋亡，从而预防及改善瘢痕增生。而对于PDL调节TGF-β1/Smad3信号通路预防及改善瘢痕增生的结论，本研究仅进行了相关性研究，未来将进行进一步严谨的功能试验以验证该机制。

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（收稿日期：2019-08-12） （本文编辑：张爽）