槲皮素对K-Ras突变型结直肠癌细胞的特异性杀伤效应

植茂辉 郑焱江刘莉华 李嘉豪 廖诗平

(四川大学华西基础医学与法医学院机能学实验室，四川 成都 610041)

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是全球发病率排名第三的恶性肿瘤[1]，主要由基因缺陷导致[2]。在众多的突变基因当中，Ras家族在结直肠癌发生和发展过程中起重要作用。该家族由K-Ras、H-Ras和N-Ras组成。Ras基因编码的Ras蛋白分子量为21 kDa，属于小G蛋白，参与细胞的信号转导过程，从而影响细胞的增殖和分化[3]。研究表明，Ras突变引起的Ras蛋白持续表达是导致多种肿瘤恶性程度增加的原因之一。在CRC中约有40%的K-Ras突变[4]，这种突变往往导致化疗耐药并加重患者的病情进展。

槲皮素一种黄酮类化合物，具有特定的分子结构且被欧洲药典所认同。迄今为止，大量研究证实了槲皮素的抗肿瘤作用，如髓性白血病[5]、神经胶质瘤[6]以及结直肠癌[7-8]。但缺乏槲皮素抑制CRC细胞系体外增殖的作用机制研究。本文拟从细胞凋亡和RAS相关信号通路的角度，研究槲皮素体外特异性抑制K-Ras突变的CRC细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

野生型人结直肠癌上皮细胞系DLD1K-RASWT和K-RAS基因突变型人结直肠癌上皮细胞系DLD1K-RAS G13D由哈佛医学院的Dr. Kevin M Haigis提供，均使用含10%胎牛血清和青霉素(10,000 U·ml-1)和链霉素(10 mg·ml-1)的DMEM培养基进行体外培养。

1.1.2 试剂

槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司，纯度：98%以上，DMSO稀释成相应的浓度)； AKT/p-AKT抗体、ERK/p-ERK抗体、JNK/p-JNK抗体、MEK/p-MEK抗体及β-actin抗体(Sigma，美国)；Annexin V-FITC流式抗体(Roche，瑞士)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美国)。

1.2 方法

1.2.1 分组

将生长情况良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞根据所加槲皮素剂量的不同，分为6组：DLD1K-RAS WT+0μM槲皮素组(wt-0组)、DLD1K-RAS WT+50μM槲皮素组(wt-50组)、DLD1K-RAS WT+100μM槲皮素组(wt-100组)、DLD1K-RAS G13D+0μM槲皮素组(1-0组)、DLD1K-RAS G13D+50μM槲皮素组(1-50组)、DLD1K-RAS G13D+100μM槲皮素组(1-100组)。

1.2.2 MTT实验

将生长情况良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞接种于96孔板中，每孔1×105个；37℃培养箱培养24 h；加入不同剂量的槲皮素培养24 h后；加入0.5 mg·ml-1MTT溶液(无血清培养基配制，4℃避光保存)110 μl继续在培养箱中孵育4 h时；弃上清，加入DMSO 200 μl溶解；25℃振荡5 min后，使用Bio-Rad酶标仪在490 nm波长下检测吸光度值(A490)。

1.2.3 集落形成实验

将生长情况良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞悬液培养于6孔板中，每孔2000个，加入不同剂量的槲皮素培养72 h后；磷酸缓冲液(PBS)清洗两次后，每孔加入4%甲醛1 ml室温固定5 min；0.1%结晶紫染色1 h，流水冲洗后晾干，获得照片。每孔加入33%醋酸1 ml溶解，每孔取200 μl于96孔板，使用Bio-Rad酶标仪于590 nm检测吸光度值(A590)。

1.2.4 Western blot实验

将生长情况良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞悬液培养于6孔板中，加入不同剂量的槲皮素培养24 h后；裂解细胞收集蛋白，经电泳、转膜、封闭、4℃一抗孵育过夜(抗体及稀释比见表1)、洗膜、二抗室温孵育2 h、洗膜、曝光后，采用Quantity ONE软件以β-actin为内参对WB条带进行半定量分析，实验所用抗体见表1。

表1 抗体来源和稀释度

1.2.5 流式细胞实验

将生长情况良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞悬液培养于6孔板中，每孔4×105个；加入0 μM、50 μM、100 μM槲皮素处理24 h后；使用胰酶进行消化，收集细胞；结合缓冲液(Binding buffer)重悬，各孔加入Annexin-Ⅴ流式抗体1 μl，室温孵育15 min；随即运用BD FAC Scan flow cytometer检测Annexin V-FITC染色阳性百分数为检测样本细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 槲皮素对细胞增殖的影响

在不同剂量的槲皮素处理下，与DLD1K-RAS WT组相比，1-50、1-100组增殖能力明显低于、wt-50、wt-100组(P<0.05)，见图1A。经过三次独立重复的集落形成实验后，与DLD1K-RAS WT组相比，1-50、1-100形成集落能力明显低于wt-50、wt-100组(P<0.001)，见图1B和1C。

图1 槲皮素抑制K-Ras突变的细胞增殖注：A：MTT染色检测DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT细胞增殖能力；B：槲皮素处理后DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT集落形成能力；C：集落形成实验定量分析结果。与对照组相比，*P<0.05。

2.2 槲皮素对细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果可看出，1-100组约有25%的细胞发生凋亡，而wt-100组凋亡率不到10%，见图2A。与DLD1K-RAS WT组相比，1-25、1-50、1-100组凋亡率明显高于wt-25、wt-50、wt-100组(P<0.001～0.01)，见图2B。

2.3 槲皮素通过激活caspase诱导K-Ras突变细胞凋亡

与DLD1K-RAS WT相比，1-50和1-100组cleaved-caspase-3表达量明显增高，见图3A。为进一步明确槲皮素诱导细胞凋亡的信号通路，分别采用caspase-3、8、9抑制剂抑制caspase信号通路，结果发现，与DLD1K-RAS WT相比，DLD1K-RAS G13D分别加入Z-DEVD、Z-IETD、Z-LEHD阻断caspase-3、8、9后再加入作用，各组凋亡均受到明显抑制(P<0.05)。Caspase-3、8、9的抑制剂均可明显抑制细胞凋亡，说明上述通路均参与了槲皮素诱导细胞凋亡，见图3B和3C。

图2 槲皮素诱导K-Ras突变的细胞凋亡注：A：流式细胞技术测定；B：细胞凋亡的定量分析。与对照组相比，*P<0.05。

图3 槲皮素激活caspase信号通路A：Western Blotting检测cleaved-caspase-3表达；B：流式细胞技术检测细胞凋亡；C：流式细胞技术检测细胞凋亡的定量分析结果。与对照组相比，*P<0.05。

2.4 槲皮素对K-Ras相关下游信号蛋白的调节作用

槲皮素处理细胞后，MEK相应的磷酸化蛋白在两种细胞中表达并无差异，而ERK蛋白磷酸化水平在两株细胞中表达水平均升高。但是磷酸化的AKT(p-AKT)在K-Ras突变的CRC细胞DLD1K-RAS G13D中的表达随槲皮素浓度增加表达降低(P<0.05), 而磷酸化的JNK(p-JNK)随槲皮素浓度增加表达升高(P<0.05)，见图4A和B。

图4 AKT信通路参与了槲皮素诱导K-Ras突变细胞凋亡注：A：Western Blotting检测K-Ras相关下游信号分子表达；B：半定量分析Western Blotting结果。与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

在结直肠癌发生发展过程中，多个基因突变参与了从腺瘤到腺癌的各个阶段[9]。在结直肠癌患者中K-Ras突变率为35-45%，被认为是肿瘤发生的早期事件之一，并与肿瘤的转移、患者的预后以及临床治疗效果密切相关[10]。Ras蛋白活化后可激活包括AKT、MEK-ERK和JNK在内的多条信号传导通路，是调节细胞增殖和分化的关键性分子[11]。目前尚没有特异性针对K-Ras的抑制剂，因此有关K-Ras突变肿瘤的治疗仍然是临床难点[12]。

本文通过研究槲皮素对K-Ras突变型和野生型CRC细胞的增殖能力影响，发现槲皮素能够抑制CRC细胞增殖，且K-Ras突变的DLD1K-RAS G13D细胞对槲皮素更加敏感。而且100μM槲皮素能诱导约25%的DLD1K-RAS G13D细胞发生凋亡，而非K-Ras变异细胞DLD1K-RAS WT凋亡率明显低于K-Ras变异细胞株。

为进一步明确槲皮素诱导的细胞凋亡的途径，我们检测了槲皮素作用后caspase家族中凋亡执行者caspase-3的活化情况，结果发现K-Ras突变的DLD1K-RAS G13D细胞在槲皮素作用后caspase-3被活化。进一步采用不同的caspase通路抑制剂作用于细胞后，槲皮素诱导细胞凋亡的能力均显著下降，可见槲皮素诱导的细胞凋亡时可能包括了caspase-8介导的外源性细胞凋亡途径和caspase-9介导的内源性细胞凋亡途径。

为明确槲皮素能够特异的诱导K-Ras突变的DLD1细胞发生凋亡的机制，我们检测经典的Ras下游信号分子活化情况。结果显示槲皮素抑制DLD1K-RAS G13D细胞种AKT和JNK信号通路的活化情况。因此我们推测，槲皮素通过调节K-Ras下游信号通路而特异性的诱导K-Ras变异细胞凋亡。

综上所述，我们的研究结果初步提示槲皮素特异性的抑制K-Ras突变的DLD1细胞增殖，能够诱导细胞通过caspase通路发生凋亡，AKT信号通路活化被抑制参与了槲皮素诱导的细胞凋亡。但是K-Ras相关众多的信号通路交错复杂，是否有其他的信号共同参与有待进一步研究。本实验结果只是选取了K-Ras突变的CRC细胞系，除了DLD1以外，槲皮素对其他的细胞系以及其他肿瘤K-Ras突变的细胞系是否有这种广谱的作用还有待证实。