芫花素对流产大鼠出血量、激素水平及子宫内膜修复的影响

樊江波，张格林

(1.西安交通大学第二附属医院妇产科，西安 710004；2.西安交通大学第二附属医院骨科，西安 710004)

芫花素为益母草中的活性物质。益母草为传统中药，主治痛经、闭经、产后出血、月经不调、产后子宫恢复不良、产后恶露不尽及赤白带下等症[1]。

Fan J B等[2]用SD大鼠子宫平滑肌CMC-online-HPLC/MS方法筛选出益母草的活性成分之一为芫花素。本实验研究芫花素对药物流产模型大鼠子宫出血量、凝血时间、雌二醇、孕酮水平及子宫、卵巢病理形态的影响，同时研究了芫花素对药物流产大鼠子宫复旧及子宫内膜修复相关细胞因子TNF-α和IL-1β影响的作用机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 UV1600比例双光束紫外可见分光光度计(浙江福立分析仪器有限公司)；GENIUS 5K型低速离心机(长沙鑫奥仪器仪表有限公司)；680型酶标仪(日本BIO-RAD公司)；Elisa反应板(美国Waters公司)；轮转式切片机(北京昊诺斯科技有限公司)；XSP-C204型显微镜(重庆光电仪器有限公司)；罗氏Cobas 6000 E601电化学发光检测仪(瑞士罗氏公司)。

1.2试药 芫花素(质量分数>98.5%，批号BBP00737)，购自云南西丽生物技术有限公司；宫血宁胶囊(规格：0.13 g×18粒，批号ZI12005)，购自云南白药集团股份有限公司；米非司酮片(规格：25 mg×6片，批号121201)，购自浙江仙琚制药股份有限公司；米索前列醇(200 μg×3片，批号43110104161)，购自北京紫竹药业有限公司；TNF-α和IL-1β血清酶免试剂盒，均购自上海科华公司；甲醛溶液(批号20111225),购自广东光华科技股份有限公司；二甲苯(批号081023),购自四川西陇化工有限公司。

1.3动物 雄性SD大鼠30只，雌性SD大鼠70只，体质量180～220 g。均由西安交通大学医学部实验动物中心提供。

2 方法与结果

2.1实验动物分组及给药 雌鼠10只作为空白对照组，其余60只雌性SD大鼠与30只雄性SD大鼠进行合笼交配，合笼比例为2∶1，观察到成功交配后，在次日清晨取雌性SD大鼠，检查其阴栓，并进行阴道液涂片，用显微镜检查精子，镜下查到阴栓及精子者52例，记录为受孕第1 d。取50只受孕大鼠，均分为5组，每组10只，分别为模型组、阳性对照组、芫花素低剂量组(0.1 mg·kg-1)、芫花素中剂量组(0.2 mg·kg-1)和芫花素高剂量组(0.4 mg·kg-1)。

2.2流产模型的建立 于妊娠第7 d上午8点和下午18点，分别给予50只孕鼠灌胃米非司酮(8 mg·kg-1，0.01 mL·g-1)和米索前列醇(100 μg·kg-1，0.01 mL·g-1)制作药物流产模型。

2.3给药方法 给予米非司酮流产次日，全部大鼠开始灌胃给药；空白对照组不给药；模型组给予生理盐水10 mL·kg-1；阳性对照组给予宫血宁10 mg·kg-1；芫花素低、中和高剂量组分别给予芫花素0.1，0.2和0.4 mg·kg-1。以上用药，每日1次，连续7 d。

2.4检测指标

2.4.1大鼠子宫出血量 给予大鼠米非司酮的同一天开始，在其阴道内放置40 mg无菌棉球，每日更换，连续5 d。将每日从大鼠阴道中取出的棉球收集在一起，放入密闭的试管中于0～4 ℃保存。在大鼠受孕后第14 d，从其眼眶静脉丛中取血20 μL，用质量浓度为50 g·L-1的氢氧化钠溶液2 mL溶解；将每只大鼠所收集到的棉球，用质量浓度为50 g·L-1的氢氧化钠溶液5 mL浸泡溶解24 h，将棉球充分挤压，使其中的血液完全浸出，将浸出液进行过滤。用分光光度计于546 nm波长处分别测定每只动物的静脉血溶解液及棉球血溶解液A值。计算每只动物的子宫出血量。

子宫出血量(μL)=[静脉血量(μL)×棉球血浸提A1值×浸泡棉球血氢氧化钠体积(mL)]÷[静脉血A2值×静脉血稀释用氢氧化钠体积(mL)]

2.4.2大鼠血浆凝血酶原时间、凝血酶时间及部分凝血活酶时间 末次给药后24 h，大鼠腹腔注射100 mL·L-1水合氯醛(0.003 5 mL·L-1)，经大鼠腹主动脉进行取血，用质量浓度为3.8 g·L-1的枸橼酸钠抗凝(抗凝剂∶血液=1∶9)充分离心后取血浆，用血凝分析仪测定大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)以及部分凝血活酶时间(APTT)。

2.4.3血清中雌二醇和孕酮水平 经大鼠腹主动脉取血5 mL，离心取血清，用罗氏Cobas 6000 E601电化学发光检测仪测定血清中的雌二醇(E2)和孕酮(P)的质量浓度。

2.4.4血清中TNF-α和IL-1β的含量 经腹主动脉取血5 mL，离心，取大鼠血清50 μL，测定TNF-α，取血清100 μL，测定IL-1β。

2.4.5大鼠子宫和卵巢组织形态学变化 剖腹取全例大鼠子宫及一侧卵巢，将大鼠子宫及卵巢标本置于100 mL·L-1甲醛溶液中固定，24 h后将固定好的子宫及卵巢组织块经常规的乙醇进行梯度脱水，用二甲苯进行透明，常规将子宫及卵巢组织块石蜡包埋，制成子宫及卵巢组织蜡块，置于4 ℃冰箱中保存待用。蜡块用轮转式切片机连续组织切片，切片厚度为3 μm。常规HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠卵巢和子宫的病理变化。

2.5统计分析 釆用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理。以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1对子宫出血量和凝血酶时间的影响 大鼠给药后，阳性对照组子宫出血量较模型组减少(P<0.01)；芫花素中、高剂量组子宫出血量较模型组减少，且存在剂量依赖性。模型组大鼠PT和TT较空白对照组显著延长(P<0.05)；阳性对照组及芫花素中、高剂量组大鼠PT及TT较模型组短。见表1。结果表明，芫花素能减少药物流产大鼠的子宫出血量，对药物流产后子宫出血有治疗作用。药物流产引起大鼠PT和TT延长，芫花素能缩短药物流产大鼠的PT和TT。

表1芫花素对药物流产大鼠子宫出血量和凝血酶时间的影响

组别剂量/mg·kg-1子宫出血量/μL PT/s TT/sAPTT/s空白对照组10.8±0.66∗25.1±2.70∗35.8±4.82模型组206.0±59.712.8±1.9528.5±2.3632.6±5.04阳性对照组10135.4±21.5∗∗10.1±0.92∗∗25.0±3.26∗34.8±4.19芫花素低剂量组0.1178.5±68.711.0±1.2627.3±1.5534.5±4.76芫花素中剂量组0.2155.1±25.8∗10.7±1.22∗25.4±1.86∗35.9±4.79芫花素高剂量组0.4133.9±13.9∗∗10.4±0.56∗∗24.9±2.17∗36.1±4.41

注：与模型组比较，*P<0.05为差异有统计学意义，**P<0.01为差异有显著统计学意义。

3.2对雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影响 模型组大鼠血清雌二醇质量浓度降低，而孕酮升高，与空白对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组及芫花素中、高剂量组药物流产大鼠血清中雌二醇质量浓度显著升高(P<0.05)。模型组大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量显著升高，与空白对照组比较差异有极显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照组及芫花素中、高剂量组药物流产大鼠体内TNF-α和IL-1β含量显著降低。见表2。结果表明，芫花素可升高药物流产大鼠体内雌二醇质量浓度和降低药物流产大鼠体内TNF-α和IL-1β含量。

表2芫花素对流产大鼠体内雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影响

组别剂量/mg·kg-1雌二醇/ng·mL-1孕酮/ng·mL-1TNF-α/ng·mL-1IL-1β/ng·mL-1空白对照组151.6±34.7∗∗12.0±4.14∗∗ 62.15±7.28∗∗ 4.38±0.83∗∗模型组 95.7±8.117.9±4.79115.39±18.1712.51±1.27阳性对照组10131.1±17.9∗∗14.1±3.72 91.56±15.93∗ 8.72±0.93∗芫花素低剂量组0.1103.2±18.315.2±7.41107.21±18.0311.79±0.98芫花素中剂量组0.2114.6±24.3∗13.6±6.78 96.85±13.43∗ 9.02±0.83∗芫花素高剂量组0.4120.7±23.7∗∗15.2±6.77 93.74±11.27∗ 8.68±0.68∗

注：与模型组比较，*P<0.05为差异有统计学意义，**P<0.01为差异有显著统计学意义。

3.3芫花素对卵巢、子宫病理形态的影响 见图1。由图1可知，各组动物的卵巢组织结构正常，皮髓质分界清楚，多级卵泡可见，不同发育阶段黄体可见，组间比较无明显差异。模型组子宫内膜较薄，大部分存在内膜不完整或脱落，内膜呈低柱状或立方状，子宫腔比正常大鼠略大，肌层与空白对照组相比较薄。阳性对照组及芫花素中、高剂量组各例子宫的浆膜、肌层、内膜结构清楚，黏膜覆单层柱状上皮，完整无脱落。固有膜中可见单管状子宫腺。子宫腔大小基本正常，肌层较厚，与正常大鼠基本相同。子宫内膜未见增生过长。

图1芫花素对卵巢、子宫病理形态的影响(100×)

①空白对照组子宫；②模型组子宫；③阳性对照组子宫；④芫花素低剂量组子宫；⑤芫花素中剂量组子宫；⑥芫花素高剂量组子宫；⑦空白对照组卵巢；⑧模型组卵巢；⑨阳性对照组卵巢；芫花素低剂量组卵巢；芫花素中剂量组卵巢；芫花素高剂量组卵巢。

Fig.1 Effects of genkwanin on uterus，ovarian pathological morphology in the medical-abortion rat (100×)

①uterus of blank control group；②uterus of model group；③uterus of positive control group；④uterus of low dose genkwanin group；⑤uterus of middle dose genkwanin group；⑥uterus of high dose genkwanin group；⑦ovarian of blank control group；⑧ovarian of model group；⑨ovarian of positive control group；ovarian of low dose genkwanin group；ovarian of middle dose genkwanin group；ovarian of high dose genkwanin group.

4 讨论

研究结果表明，芫花素可有效减少药物流产大鼠的子宫出血量，缩短大鼠PT和TT，升高药物流产大鼠体内雌二醇的质量浓度，对药物流产后子宫出血有治疗作用。可能与芫花素可促进药物流产大鼠子宫内膜增生恢复、促进子宫平滑肌收缩、导致流产大鼠子宫腔较快时间恢复至正常大小有关。这也为产后子宫复旧不良、恶露不净的治疗提供了依据，通过进一步研究其作用机制，芫花素有望用于临床治疗产后子宫复旧不良等。

病理研究表明，模型组10例中有6例子宫内膜不完整或脱落，子宫腔比正常大鼠略大；阳性对照组子宫内膜较厚，表面被覆单层柱状上皮，子宫腔较小，接近空白对照组；芫花素低剂量组子宫内膜为单层柱状、低柱状或立方状上皮，10例中有2例内膜不完整或脱落，子宫腔略大于正常对照组；芫花素低剂量组10例中有2例内膜不完整或脱落，子宫腔略大于空白对照组；芫花素中、高剂量组子宫内膜为单层柱状上皮，内膜结构清楚，完整无脱落，子宫腔大小正常。病理结果提示，芫花素可促进药物流产大鼠子宫内膜增生恢复，促进子宫平滑肌收缩，恢复子宫腔正常大小。

产后子宫复旧不良的机制可能与卵巢激素、内膜修复及止血过程有关。韩秀君等[3]用益母草治疗产后子宫复旧不良及恶露不净；李春梅等[4]研究产后子宫复旧以及子宫内膜的修复机制，表明益母草对子宫蜕膜崩解、内膜修复、排出恶露及调节子宫张力作用良好。

TNF-α具有双重作用，一方面在机体生理功能和抗感染等方面发挥免疫调节的重要作用，另一方面若TNF-α持续释放或产生过多则呈现其毒性作用，产生的免疫反应剧烈。NF-κB可调控TNF-α的产生，而TNF-α释放增加又促进了IκB的磷酸化，这使NF-κB进一步激活，从而延续炎症反应的复杂环路调节，导致了最初的炎症信号进一步放大[5-7]。子宫内膜炎的发生与NF-κB途径的激活密切相关，研究发现，可通过抑制NF-κB信号通路达到减弱子宫内膜炎症[8-10]，促进子宫内膜修复[11-13]。白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)又名淋巴细胞刺激因子，在机体中发挥着重要的作用，在细胞免疫的激活过程中具有调节作用[14-15]。在机体中，IL-1β参与许多生理过程，能刺激PDGF、集落刺激因子等细胞因子的产生[16-18]，在组织修复和免疫应答过程中起重要作用[19-20]。

本实验研究了芫花素对药物流产大鼠子宫复旧及子宫内膜修复相关细胞因子TNF-α和IL-1β含量的影响，芫花素中、高剂量组能显著降低药物流产大鼠体内的TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)，提示芫花素可能参与了子宫复旧及子宫内膜修复过程，能减轻炎症反应、促进子宫复旧及子宫内膜修复。