基于纳米递送系统的黑色素瘤免疫治疗的研究进展

戴 爽，覃虹锟，王鑫怡，宗 莉*，王亚菁*

(1.中国药科大学药学院药剂学教研室，南京 211198；2.中国药科大学基础医学与临床药学学院生理学教研室，南京 211198；3.中国药科大学药学院药物分析教研室，南京 211198)

黑色素瘤是一种恶性皮肤癌，其发病率占皮肤癌的5%，致死率却高达皮肤癌相关死亡的75%[1]。早期黑色素瘤主要通过手术切除进行治疗，但晚期和已转移的黑色素瘤极难治疗，死亡率极高，晚期黑色素瘤病人5年生存率低于20%[2]。转移瘤的治疗主要包括化学治疗[3]、放射治疗[4]、靶向治疗[5]和免疫治疗[6]。其中免疫治疗近年来成为黑色素瘤治疗的研究热点之一，而与纳米递送系统联用更是有望解决黑色素瘤免疫治疗的现存问题。本文就基于纳米递送系统的黑色素瘤免疫治疗研究现状进行简要综述。

1 黑色素瘤免疫治疗现状

黑色素瘤是最具有免疫原性的肿瘤之一，易于逃脱免疫监控、易转移复发。免疫治疗已被应用于黑色素瘤的治疗[7]，主要包括细胞因子治疗[8]、免疫检查点阻断免疫治疗[9]、过继性免疫治疗[10]和嵌合抗原受体T细胞免疫治疗[11]等。

免疫检查点抑制剂获批之前，美国FDA批准采用化疗(氮烯唑胺)、羟基脲或免疫治疗(高剂量IL-2)作为晚期黑色素瘤的治疗方案[1，12-13]。这些方案首次给药有效率较高，能显著提高总体生存率，但一般6～9个月后就会复发[14]。IL-2可延长缓解期，但其半衰期短，需要多次大剂量注射，具有严重的不良反应[15]。2011年，美国FDA批准了首个免疫检查点抑制剂ipilimumab(CTLA-4抑制剂)，用于治疗晚期黑色素瘤，此后免疫检查点抑制剂成为公认的晚期黑色素瘤免疫治疗有效策略，显著推进了晚期黑色素瘤免疫治疗的发展。但免疫检查点抑制剂仅对很小一部分病人有效，大部分病人对此类抑制剂没有免疫响应。

2 纳米递送系统的应用

纳米递送系统，即纳米尺寸(1～100 nm)的药物递送系统，包括无机材料、有机材料和细胞仿生型等载体系统，具有降低给药剂量、延长抗原呈现时间、增加稳定性和诱导产生更强烈的T细胞免疫反应等优点，有望用于晚期黑色素瘤的治疗[16-18]。

2.1无机纳米载体 无机纳米载体主要是指无机材料(如金[19]、铁[20]、石墨烯[21]和介孔硅[22]等)构建的纳米载体，具有粒径小、尺寸可调、比表面积大、易修饰、稳定性好和理化性质特殊等优点。

无机纳米载体应用于黑色素瘤免疫治疗，可增强诱导抗原特异性T细胞的增殖，促进效应T细胞发挥作用。纳米技术为免疫治疗提供了新的递送策略，但要实现高效激活T细胞仍待进一步完善。Steenblock E R等[23]报道，纳米粒诱导产生的短期免疫反应远不如微粒。Perica K等[24]基于生物相容性氧化铁纳米粒(50～100 nm)或生物素包裹的量子点纳米晶(约30 nm)2种纳米制剂，构建了人造抗原呈递细胞(APCs)纳米递送系统。体外实验表明，构建的2种载体都能诱导小鼠脾脏细胞和人外周血T细胞产生抗原特异性T细胞增殖。选用接种黑色素瘤细胞B16的裸鼠进行体内实验，能有效预刺激特异性细胞毒T淋巴细胞，减缓肿瘤生长，且效果优于对照的人造APCs微米递送系统。

此外，无机纳米粒因其独特的光、电、磁性质，在显影成像方面具有一定优势。常用的细胞追踪方法是通过报告基因标记细胞，该标记方法持续时间较长，存在组织透光性差、无法定量等问题[25]。Meir R等[26]人工改造T细胞使其可以表达黑色素瘤特异性T细胞受体，并标记上葡萄糖修饰的金纳米粒(约20 nm)作为计算机断层扫描(CT)造影剂，将该T细胞静脉注射进入移植了人黑色素瘤的小鼠体内，可以追踪检测T细胞在体内的分布、迁移和动力学。金纳米粒不影响人工T细胞在小鼠体内的分布和功能，且能稳定标记在T细胞上，用于T细胞的CT追踪。Chen F等[22]采用Cy5荧光二氧化硅纳米粒，与黑皮素受体1(MC1-R)靶向的α黑色素细胞刺激素(αMSH)肽结合，用于黑色素瘤特异性显影。MC1-R是靶向黑色素瘤特异性标志物的一种多肽，但由于肾摄取过多影响了其在临床效果和治疗中的应用，该二氧化硅纳米粒能有效解决这一问题。通过表面修饰优化的αMSH肽，纳米粒与MC1-R的亲和力能提高10倍。体内实验表明，该二氧化硅纳米粒在黑色素瘤小鼠模型中能有效靶向肿瘤，示踪显示其易通过受体介导的方式被肿瘤细胞内吞。该纳米递送系统较好地克服了现有临床黑色素瘤抗体类探针的耐药和脱靶毒性等缺点，有望用于黑色素瘤特异性显影和治疗。

2.2有机纳米载体 有机纳米载体一般指以天然或合成有机高分子材料制备的纳米粒。天然高分子材料包括壳聚糖[27]、海藻酸钠[28]、透明质酸[29]和当归多糖[30]等，合成高分子材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)[31]、聚乙烯亚胺(PEI)[32]和聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子聚合物[33]等。有机高分子材料一般具有毒性低和生物可降解性等优点。有机纳米递送系统既能通过载体修饰提高递送效率和抗原呈递效率，又能保护免疫疫苗不被降解，高效低毒地将药物递送至特定部位。

有机纳米载体能够降低剂量，减小毒性，尤其是对于半衰期较短、剂量较大的药物。IL-2具有抗肿瘤活性，但重组IL-2蛋白在血清中半衰期短，需要重复大剂量注射才能起到效果，因而具有严重的不良反应[34]。Yao H等[35]在低相对分子质量聚乙烯亚胺(600 Da)上连接β环糊精，再修饰上叶酸，将制备得到的高分子材料和IL-2质粒混合制备成约100 nm的复合物。癌旁注射该复合物能有效抑制肿瘤生长，延长B16-F1黑色素瘤移植C57BL/6小鼠的生存期。此外，该复合物能刺激外周血中CD8+，CD4+ T细胞和自然杀伤细胞的激活和增殖，并增加其向肿瘤环境中的渗透。Park J等[36]采用脂质聚合物凝胶递送高剂量IL-2至免疫抑制的肿瘤微环境中，结果表明，该纳米制剂能有效提高生存率和自然杀伤细胞活性，延缓黑色素瘤生长。

有机纳米载体能够将包裹的抗原递送给APCs，保护抗原肽等不被酶解，提高稳定性。黑色素瘤免疫治疗中常涉及抗原肽的递送问题。有机高分子材料，如PLGA，形成的纳米粒能有效保护抗原肽。有报道应用PLGA纳米粒用于递送小鼠黑色素瘤抗原多肽重组人gp100(hgp100)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)。当注射进黑色素瘤小鼠后，与多肽和弗氏佐剂的混合制剂相比，这些载多肽的PLGA纳米粒被树突状细胞(DCs)摄取更多，且诱导产生抗原特异性T细胞反应更加强烈[17]。通过表面修饰DCs特异性或阳性的受体/生物标志物，可显著提高纳米粒递送到DCs的效率，促进摄取和内化，增强抗原呈递给T淋巴细胞的能力[16，37]。

此外，载抗原纳米粒有助于抗原被DCs摄取，避免疫苗制剂导致的过度炎症反应(如铝盐，弗氏佐剂)。另外，鉴于可溶性蛋白或多肽是通过胞饮被APCs摄取，体内极少呈现为膜上的主要组织相容性复合体(MHC)配体，聚合物纳米粒包裹的抗原通过吞噬作用被内化，能更有效的通过MHCⅠ类途径被交叉呈递给CD8+细胞[38]。因此，聚合物纳米粒介导的抗原递送系统可以诱导产生强烈的T细胞免疫。

2.3细胞-纳米仿生型载体 近期，细胞或细胞膜载体被用于药物递送，包括红细胞[39]、巨噬细胞[40]、自然杀伤细胞[41]和干细胞[42]等。与外源性递送系统相比，细胞载体属于内源性载体，免疫原性低，且具有长循环、自主靶向等优点，在黑色素瘤免疫治疗中有一定的优势[43]。

免疫细胞等循环细胞近年来成为新型递送载体，具有长循环等特点，有些免疫细胞还具有肿瘤趋向性。Xie Z等[44]选用人外周血的单核细胞(THP-1)，摄取包裹维罗非尼(Vemurafenib)的聚合物纳米粒进入胞内，形成单核/巨噬细胞递送系统，以靶向治疗黑色素瘤。THP-1作为单核细胞模型，与肿瘤细胞和炎症细胞之间的亲和力高。利用THP-1作为免疫细胞靶向肿瘤细胞的能力，内吞可降解纳米粒，通过细胞内载药，实现肿瘤特异性药物递送。体外实验结果表明，基于THP-1的纳米粒递送系统能有效发挥维罗非尼对1205Lu和WM35 2种黑色素瘤细胞的杀伤作用。这种递送系统不仅有望用于其他免疫治疗药物的递送，也有望用于其他涉及固有免疫反应的疾病。

抗原呈递给APCs是启动免疫应答的关键步骤，一些天然的微生物处于微米级尺寸，易被APCs识别，发挥疫苗佐剂的作用，如酿酒酵母S.cerevisiae可靶向递送抗原至APCs，且无病原性，能起到免疫佐剂的作用[45]。Liu D Q等[46]采用重组酿酒酵母作为疫苗载体，该重组酿酒酵母的细胞壁上能表达黑色素瘤相关抗原Trp2，并通过静电作用在酵母细胞壁上修饰包裹了吲哚2,3-双加氧酶(IDO)siRNA的PEI纳米粒，以克服免疫抑制。该细胞递送系统递送的特异性siRNA能被APCs有效摄取，产生强烈的抗肿瘤免疫反应和siRNA的用量和毒性。体内外实验表明，该酵母细胞递送载体能有效抑制DCs中的IDO表达，促进抗Trp2的T细胞免疫反应，降低了调节性T细胞的产生。此外，重组酒酿酵母递送系统通过削弱免疫抑制，促进Trp2特异性CD8+ T细胞免疫应答，显著抑制了小鼠黑色素瘤生长。

除了一些细胞载体外，也有一些是只基于细胞膜设计的递送系统，具有生物组成、抗原成分和理化性质方面的优点。Guo Y等[47]采用红细胞膜包裹PLGA纳米粒，构建了一种新型抗原肽递送系统。该系统兼具PLGA纳米粒的载药功能和红细胞膜的固有性质。红细胞可用于将抗原靶向递送给DCs，诱导产生细胞毒性T淋巴细胞反应。作为抗原载体，红细胞膜可以保护抗原不被血液清除，递送抗原，APCs处理后直接将抗原递送给免疫细胞[48]。将DSPE-PEG-甘露糖组装到红细胞膜上，构建了DSPE-PEG-甘露糖-红细胞膜载体，再将载有hgp的 PLGA纳米粒(双硫键连接hgp和PLGA)包裹其中，形成的递送系统能够有效靶向淋巴组织中的APCs，体内外实验表明，对黑色素瘤均具有较好的疗效。

3 小结

作为最难治疗的肿瘤之一，晚期黑色素瘤一直处于肿瘤免疫治疗的前沿[49]。除了免疫检查点抑制剂外，一些其他新型免疫治疗方式也正在探索发展中[50]，包括溶瘤病毒疗法[51]和治疗疫苗[52]等。但目前的黑色素瘤免疫治疗存在不良反应、响应低和复发高等问题[18，53-54]。

纳米递送系统有望解决黑色素瘤免疫治疗现存的问题。无机纳米递送系统，不仅能增强治疗效果，还能实现成像和追踪。有机纳米递送系统，既能保护免疫多肽和核酸不被降解，又能实现药物的缓释控释。细胞-纳米仿生型递送系统不仅能避免外源性递送系统的高免疫原性，还能自主靶向，提高递送效率，增强疗效。

虽然将纳米递送系统应用于黑色素瘤免疫治疗的研究取得了许多进展，但仍存在一些问题有待解决。如纳米递送系统所依赖的EPR效应存在一定的局限性，无法应用于肿瘤内低灌注和缺氧的部分[55]。纳米递送系统进入机体后，易被网状内皮系统清除，限制了其在黑色素瘤免疫治疗中的实际应用[56]，这些需要进一步的研究改善。

近年来基于纳米递送系统的黑色素瘤免疫治疗有了许多进展，但还存在纳米递送的实际靶向效果远低于理论设计、机体免疫应答的个体差异大和晚期黑色素瘤生存期短等问题。基于纳米递送系统的黑色素瘤免疫治疗有待进一步研究和完善，以应用于临床。