长链非编码RNA RPLP0P2在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞增殖的影响研究

张海强 陆蓉丹 杨允奔 谭麟

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，位列全球癌症死因的第3位[1]。胃癌患者如能早期诊断、手术和化疗可延长生存期，然而多数患者确诊时已是晚期，失去最佳治疗时机[2]。因此，寻找合适的肿瘤标志物对胃癌早期诊断意义重大，但是目前临床常用的胃癌标志物不多，且灵敏度、特异度也并不理想[3]。长链非编码RNA（LncRNA）是一种新发现的RNA，已证实在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用[4-5]，通过影响转录、逆转录过程调节基因的表达[6-7]。研究发现，LncRNA表达异常是胃癌发生、发展的重要机制[8-9]。LncRNA RPLP0P2基因位于人染色体11q12.2上。本研究采用qRT-PCR技术，检测胃癌组织中RPLP0P2的表达，分析不同临床病理特征患者RPLP0P2表达水平的差异，并通过转染小干扰RNA（siRNA）行基因敲除的方法观察RPLP0P2对胃癌细胞增殖的影响，以探讨其是否能作为胃癌诊治的生物标志物，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 选取2011年9月至2012年2月宁波大学医学院附属医院收治的行手术切除治疗的胃癌患者56例，患者手术前均未行化疗，留取术中切除的胃癌组织与配对的癌旁正常组织，将组织标本浸入RNA固定剂（北京bioteke公司）中，储存在-80℃环境中备用。同时收集患者临床病理资料，包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期、Borrmann分型、Lauren分型、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）等。

1.1.2 实验细胞株 人胃癌细胞株（BGC-823、SGC-7901）及正常胃上皮细胞（GES-1）购自上海生物化学与细胞生物学研究所。使用RPMI 1640培养基（美国Invitrogen公司）进行细胞培养，其含10%FBS，培养温度37°C，二氧化碳浓度 5%。

1.2 方法

1.2.1 胃癌组织与癌旁正常组织RPLP0P2表达水平检测 采用qRT-PCR法。使用Trizol液（美国Invitrogen公司）提取胃癌组织、癌旁正常组织的总RNA。分光光度计（美国Denovix公司）检测总RNA浓度。光密度（OD）260/OD280值约1.8认为提取的总RNA质量良好。然后，使用GoScript逆转录试剂盒（美国Promega公司）将2μg总RNA逆转录为cDNA；用80μl无RNA酶的蒸馏水稀释cDNA；使用5μl cDNA在PCR仪（美国Stratagene公司）上进行qRT-PCR反应，以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为对照，以ΔCt值反映RPLP0P2表达水平。RPLP0P2、GAPDH引物序列由上海生工生物技术公司合成。RPLP0P2引物序列：正义链5′-TGGGAACCAAGAAGACAAGC-3′， 反义 链 5′-GTGGGCGGAGAGGAGTTAT-3′。GAPDH 引物序列：正义链 5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反义链 5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。

1.2.2 RPLP0P2对胃癌BGC-823、SGC-7901细胞与正常胃上皮GES-1细胞增殖的影响

1.2.2.1 siRNA的合成 以RPLP0P2序列为基础，由上海吉玛制药有限公司合成稳定的化学修饰的siRNA Oligo，用于实验。RPLP0P2 最有效的 siRNA（si-RPLP0P2）和稳定的阴性对照siRNA(si-NC)序列分别为：5′-GCCCUUAAUGCAAAGUGUATT-3′、5′-UUCUCCGAACGUG UCACGUTT-3′。

1.2.2.2 siRNA的转染 将BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞接种于6孔板，每孔接种数量以能在24h内使细胞汇合度达到30%～50%为准。将培养液换成1.5ml Opti-MEMI低血清培养基（美国生命科技格林德艾兰公司）。用500μl Opti-MEMI低血清培养基稀释并混合si-RPLP0P2和脂质体2000，并设立si-NC对照。将500μl复合物加入6孔板中，来回轻柔摇晃混匀。37℃细胞培养箱中孵育4～6h后除去复合物，更换不含双抗的完全培养基。

1.2.2.3 细胞增殖实验 向E-plate 96板中加入完全培养液100μl/孔，放入培养箱内的实时细胞分析仪（北京顺能电子仪器有限公司）中，待计算机程序读取完背景值后取出[1]。制备分别转染si-RPLP0P2、si-NC后的BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞悬液，自动细胞计数仪（美国贝克曼库尔特公司）计数。稀释细胞悬液，调整细胞浓度至5×104个/ml。向E-plate 96板中加入稀释好的细胞悬液100μl/孔，静置30 min后放入实时细胞分析仪中继续培养。每组细胞设置8个复孔，实时细胞分析仪每15min检测1次细胞指数（CI），以CI反映细胞增殖情况。

1.3 观察指标 （1）比较胃癌组织与癌旁正常组织RPLP0P2表达水平；（2）比较不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平；（3）比较转染si-RPLP0P2与转染 si-NC 的 BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞增殖情况。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，胃癌组织与癌旁正常组织RPLP0P2水平比较采用配对t检验；不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2水平比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析；转染si-RPLP0P2的细胞与转染si-NC的细胞CI比较采用两独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织RPLP0P2表达水平比较见图1。

图1 胃癌组织与癌旁正常组织RPLP0P2表达水平比较（n=56，*P＜0.05）

由图1可见，胃癌组织RPLP0P2表达水平明显高于癌旁正常组织RPLP0P2表达水平（P＜0.05）。

2.2 不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平比较见表1。

表1 不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2水平比较（ΔCt值）

由表1可见，除Borrmann分型、肿瘤大小以及是否有神经侵犯外，不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平比较均无统计学差异（均P＞0.05）。即胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平不受患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化程度、TNM分期、Lauren分型、CEA、CA19-9等影响。

2.3 转染si-RPLP0P2与转染si-NC的BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞增殖情况比较见图2。

图2 转染si-RPLP0P2与转染si-NC的BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞增殖情况比较（n=16；与转染si-NC比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

由图2可见，与转染si-NC相比，转染si-RPLP0P2的胃癌BGC-823、SGC-7901细胞与正常胃上皮GES-1细胞增殖受抑制，即下调RPLP0P2会抑制细胞增殖。

3 讨论

恶性肿瘤是一种发病机制复杂的疾病，其发生、发展是受多种因素的影响。直至今日人们仍然未能清楚阐述其发生、发展的具体机制。目前，临床检测胃癌的生物标志物主要是CEA和CA19-9，但两者的灵敏度与特异度均不甚理想[4-5]。寻找灵敏度、特异度更高的胃癌标志物是研究热点。近年研究发现，LncRNA在肿瘤的发生、发展中扮演重要的角色，其通过影响相关基因的表达、干扰信号通路开关发挥作用[6-7，10]。LncRNA中部分起抑制恶性肿瘤基因的作用，有的则起促进细胞恶变的作用。第一个被发现的恶性肿瘤相关LncRNA H19，其可以促进恶性肿瘤细胞发生、发展，反向调节细胞凋亡，使细胞缺氧耐受能力提升以及加速血管生长。

本研究结果显示，胃癌患者的胃癌组织中RPLP0P2表达水平明显高于癌旁正常组织。此外，除Borrmann分型、肿瘤大小以及是否有神经侵犯外，不同临床病理特征的胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平比较均无统计学差异。即胃癌患者胃癌组织RPLP0P2表达水平不受患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化程度、TNM 分期、Lauren分型、CEA、CA19-9等影响。

本研究以si-RPLP0P2转染胃癌BGC-823、SGC-7901细胞与正常胃上皮GES-1细胞，以敲除RPLP0P2，观察细胞增殖情况。结果显示，与转染si-NC相比，转染si-RPLP0P2的胃癌BGC-823、SGC-7901细胞与正常胃上皮GES-1细胞增殖受抑制，即下调RPLP0P2会抑制细胞增殖。这表明，RPLP0P2可能使胃癌发生的癌基因。

综上所述，RPLP0P2在胃癌组织中表达上调，下调RPLP0P2可抑制胃癌细胞增殖。RPLP0P2或可成为胃癌的生物标志物与潜在的治疗靶点。