干细胞诱导内耳相关细胞再生的研究进展

石琳钰 陈始明

听觉系统的复杂性使听力容易受到损伤[1, 2]。过度的听觉刺激、耳毒性药物的使用或局部缺血缺氧等因素可引起毛细胞(hair cell，HC)及与之相连的神经元受损，导致感音神经性聋(sensorineural hearing loss，SNHL)[3～8]。SNHL是一种发病率很高的全球性疾病，据世界卫生组织统计，其影响了全球约3.6亿人口[9]。虽然现在助听器佩戴和人工耳蜗植入等手段为大多数此类患者提供了治疗的选择，但这些治疗手段也存在明显的局限性，比如需要佩戴外部装置、费用昂贵等。随着对听力受损机制研究的不断深入，越来越多的研究显示干细胞(stem sell，SC)移植治疗SNHL具有潜在的可行性[10]。

SC是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，其可获取周围环境信息定向分化成不同特异性表型的细胞，使其在分化成新的功能细胞以替代病变或衰老的细胞方面存在巨大的应用潜能[10]。在SNHL研究方面，已发现SC可分化成新的HC及神经元等细胞，这为干细胞移植以取代部分病变的内耳相关细胞提供了可行的选择[11]。本文就不同种类干细胞移植诱导内耳相关细胞再生的研究进展进行综述，对目前研究存在的局限及未来的研究方向进行展望。

1 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)

体外研究表明，鼠SC可以诱导逐步分化为内耳的HC和螺旋神经节(spiral ganglion neurons，SGN)细胞[12]。从ESCs产生内耳HCs和SGNs的重点在于找到合适的培养方案诱导SC分化为HC或/和SGN细胞，并证明分化产生的细胞具有相应的生理功能。

Oshima等[13]发现ESCs可以诱导生成具有功能的HC，其诱导ESCs得到的类HC中含有毛细血管团和与天然前庭HC类似的激肽释放酶，并表达许多HC相关标记物且显示出对机械作用的敏感性；该研究进一步体外使用FBS、胰岛素样生长因子-1、Dkk1(Wnt信号抑制剂)、SIS3(Smad3抑制剂)以及FGF2刺激ESCs，最终得到类HC。但这种培养方式必须在有丝分裂的鸡囊细胞层上进行，这种对外源组织的需求限制了该法的常规使用。另外，该研究报道HC的诱导效率较低，仅占细胞总数的1%～2%。

随后出现的3D培养系统避免了外源性组织的限制。Koehler等[14]通过使用KSP(培养基补充剂)、BMP4、TGF-β、SB(TGF-β抑制剂)、LDN(BMP抑制剂)、TGF2等因子建立了3D培养系统。在整个培养过程中精确把握各个阶段的处理时机以及SC发生的各种形态转变，最终，在含有细胞外基质蛋白的培养基中，ESC诱导分化成内耳HC、支持细胞和前庭感觉神经元样细胞，同时还观察到分化形成的感觉神经元样细胞与衍生的HC形成了特殊的突触连接。DeJonge等[15]在3D培养系统中对ESC分化过程进行研究发现，加入强效Wnt激动剂调节Wnt信号传导通路可以增强内耳感觉细胞的分化。

由ESCs分化为HC的培养方案中，除应用外来细胞因子调控分化进程外，细胞自身基因也在其中发挥重要作用。体内内耳器官发育过程中有两个关键点：向非神经外胚层分化点和耳基板分化点。在形成耳基板时，内耳膜迷路所发生的外胚层中，FGF信号传导导致转录因子Pax2上调[16]。Schaefer等[17]使用携带Pax2EGFP等位基因的小鼠作为实验组，其中EGFP插入Pax2翻译起始位点上游，相同遗传背景的野生型(WT)小鼠作为对照组；挑选出Pax2 EGFP/+基因型的子代并从已孕雌性小鼠中获得ESCs，体外诱导培养获得的ESCs结果显示，从建立的突变小鼠中获取的ESCs可以最终分化为成熟的HC，Pax2EGFP等位基因是验证干细胞是否分化为成熟HC的较好实验手段。

SNHL患者内耳HC再生后同样要求建立完整的神经支配以实现其功能。不同于分化为HC的培养方法，Perny等[18]模拟体内内耳发育的最重要步骤，开发了基于类器官培养系统的具体分化方案，用来指导小鼠ESC向耳感觉神经元(OSN)的分化。在无血清条件下，该研究团队在基质胶中使用快速聚集方法启动ESCs向外胚层逐步分化，然后通过激活BMP信号传导并抑制TGFβ信号传导以防止内胚层的诱导，从而诱导非神经外胚层。Perny等[18]通过抑制BMP信号传导和添加FGF2进一步诱导出基板前体和耳基板外胚层，补充脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT-3)用于OSN细胞进一步分化成熟，最终培养出具有明显双极形态和功能兴奋性的大量神经元；随后他们检测发现ESC衍生的OSN显示出天然SGN的功能性电生理学特性。

上述研究在使用细胞培养技术来诱导ESC分化产生内耳相关细胞方面取得了较大的进展；然而，因诱导效率问题尚未解决，培养的结果仍不令人满意。现有多种培养方案可诱导ESCs分化为HC和神经元细胞，但分化过程中的关键基因、细胞因子以及培养方式的选择等仍需进一步优化；而且，除定向分化为所需的目的细胞外，还要尽可能提高分化效率。

2 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)

耳蜗NSCs耳内移植治疗SNHL是另一种有潜力的方法[20]；它们不仅可以增强内耳神经元的分化和存活，还支持耳蜗HC的再生[21]。在体实验表明，NSCs可以用来再生并替代失去的神经元。将NSCs成功移植到小鼠内耳后发现，移植的细胞存活数周后即表达了神经胶质细胞、神经元细胞和HC的标记物，并在失神经耳蜗(denervated cochleae)中与HCs形成了细胞连接[22～24]。Hu等[25]将耳蜗轴打开并将听神经纤维完全切断，然后将NSCs移植到听神经纤维的断端，结果发现NSCs不仅可沿着内听道的听神经纤维迁移，还进一步向中枢方向迁移，到达脑干并临近耳蜗腹核。对于SNHL的治疗，由于一些细胞因子、生长因子以及酶类等大分子在通过血脑屏障时会受到障碍，因此在应用时会有一定的限制。神经再生中，除雪旺细胞外，基底膜及神经生长因子都是必不可少的因素。易天华等[26]认为NSCs移植到神经损伤区域后，在分化生长为雪旺细胞的同时还可分泌一些有利于神经生长的因子，所以采用NSCs细胞替代疗法治疗神经褪变不仅能够顺利通过血脑屏障，且在耳蜗中移植更直接有效。对于人工耳蜗植入者必须有最低限度数目的SGN细胞存活，才能保证相对好的移植后听觉识别能力。目前的研究重点是寻找促进NSC增殖和神经分化的方法或药物，这可能极大地促进基于干细胞治疗SNHL的发展。

目前用SC或祖细胞移植再生或恢复神经损伤的动物研究已经证实NSCs临床应用的可能性。然而，其再生机制尚不清楚，目前存在的疑问有：①是否由通过移植的细胞直接替换受损细胞？②是否由移植的细胞旁分泌所释放的细胞因子、生长因子和激素作用于原先存在的细胞从而产生新的神经细胞？这可能是今后的研究方向之一。

3 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)

MSC具有自我修复、自我更新、高度增殖分化潜能和贴壁生长的特点，通过特定的诱导可向骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞和上皮细胞转化[27]。MSC有多种来源，例如：骨髓、脂肪、肝脏、羊水、胎盘、脐带和牙齿等[28]，其优势在于高扩增潜力、遗传稳定性、易于从实验室收集、易迁移至受损部位的能力和自体或异体移植中强大的免疫抑制特性等。目前分别有来自骨髓、脐带和脂肪来源的MSC诱导分化成内耳相关细胞的研究报道。

Matsuoka等[29]认为替代丢失的SGN神经元的可能候选干细胞是骨髓衍生的MSC，其通过沙鼠动物实验直接将BMSC注射到受损耳蜗的蜗轴中发现这些干细胞最终被成功移植，且移植后存活的MSCs可能会导致受损的SGNs再生，促进听功能的恢复。在特定的生长因子如视黄酸存在时，BMSCs可分化为感觉神经元[30, 31]。Lee等[32]在大鼠BMSC的培养基中加入胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、BDNF和NT-3等，结果显示BMSC可分化为神经元祖细胞并进一步分化为神经元细胞。BMSC除可分化为神经元细胞外还可分化为HC。Mahmoudian-Sani等[33]发现人BMSCs可以通过RA、bFGF和EGF的作用分化成类HC样细胞，其细胞形态未发生改变，但qRT-PCR检测出 SOX2、POU4F3、ATOH1表达水平明显上调，而这3种基因在耳蜗HC的发育和存活中发挥重要作用。哺乳动物耳蜗间质非感觉区的耳蜗纤维细胞在维持正常听力中发挥重要作用。Kamiya等[34]建立了由线粒体毒素诱导的、纤维细胞功能障碍引起的急性感音神经性听力损失的大鼠模型，将BMSC移植到该模型动物的外半规管中，通过ABR检测发现，与对照组相比，移植BMSC后大鼠的听力明显提高。上述研究结果表明BMSC可成功移植于耳蜗，并可能提高部分听功能。虽然其发挥作用的具体机制仍不清楚，但其潜在的应用前景已经非常明显。

人脐带细胞即Wharton’s Jelly 细胞，也称为人脐带间充质基质细胞(hUCMSCs)，是另一个MSCs的优良来源[35]。hUCMSCs的主要优点之一是它们保留了从所有三个胚层分化成多种细胞类型的能力[35]。用表达Atoh1的载体处理这些hUCMSC，可以诱导其分化成表达HC特异性标记的HC样细胞[36]，使其成为治疗SNHL和平衡障碍的候选者之一。

据报道，脂肪组织来源的MSCs(adipose-derived stem cells， ASCs)可以迁移到组织损伤部位并分泌营养因子[37]，这使其也成为MSC的组织来源候选者之一。Fetoni等[37]对自身免疫性聋的豚鼠全身输注ASCs后发现ASCs可从外淋巴管迁移到内淋巴管；且在噪声暴露下，移植了ASCs的豚鼠耳蜗组织中与PDGF、VEGF和TGF-β途径相关的趋化因子配体和受体的表达明显增加。虽然在整个实验过程中，ASCs移植并没有改善豚鼠的听功能，但也没有引起任何额外的听力损失；另外，研究发现ASCs可诱导脾细胞中抗炎细胞因子IL-10的产生，同时诱导产生CD4+、CD25+、Foxp3+Treg细胞，从而抑制自身抗原特异性T细胞应答，增强免疫抑制性[38]。因此，ASCs是干细胞移植的可能选择之一，因它的高可塑性、营养特性以及免疫抑制特性，局部注射可与常规疗法(如人工耳蜗植入)相结合，以增强损伤早期的内源性修复过程并促进听功能的恢复[39]。

以上几项动物研究已证实成功接种MSC后，MSC可以分化为类HC和SGN细胞，并可部分恢复受损的听力，或通过营养作用等保护已受损细胞，但MSC是否可以应用于人类听力损失的治疗仍需临床研究进一步来验证。因此，Lee等[40]针对SNHL患者进行了两项临床试验，其中一例患有听神经病，另一例患者则是颅内转移瘤开颅术后因眶周痉挛行微血管减压术后出现了听力障碍，通过自体BMSC移植治疗后，这2例患者均未找到与干细胞移植相关的任何并发症和副作用，且在随访的12个月内纯音测听、耳声发射和ABR监测均未出现任何改变；在输注MSC治疗3年后，患者未出现任何并发症；该试验验证了SNHL患者自体BMSC治疗的安全性，但其治疗效果有待提高。

4 诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)

iPSCs与ESCs在分子结构和功能特征上非常相似，并且是多能干细胞的新来源。目前认为体细胞工程可以产生几乎所有细胞类型的首选方法之一就是iPSC[41]。

Ohnishi等[42]报告仅用bFGF在无血清的培养基中诱导iPSC 71天后可成功分化为HC样细胞团，通过扫描电镜发现，培养产生的细胞类型有上皮样细胞和神经元样细胞，且少数上皮样细胞顶端可以观察到静纤毛样突起。Koehler等[43]也通过体外细胞培养技术培养出类HC样细胞。与Ohnishi等不同的是，Koehler等不是使用单一的诱导因子而是采用3D培养系统，通过加入TGF、BMP、FGF和Wnt信号因子从单个iPSC聚集体诱导产生多个耳泡状结构。通过检测，这些耳泡状结构均表现出与天然感觉HC相似的电生理学特征。

MYO15A基因突变与部分亚洲和欧洲家庭中的重度先天性感音神经性聋有关[44]，而 MYO15A是非常规肌球蛋白超家族中一员，并且是HC中静纤毛正常发育所必需的蛋白[45]。Chen 等[46]从MYO15A c.4642G4A和c.8374G4A突变的家族成员中获得iPSC，并成功诱导iPSC分化为HC样细胞，然后应用CRISPR / Cas9技术和靶向载体两种形式的同源重组模板来修复iPSC中的MYO15A c.4642G4A突变，最终发现此种方法可以修复MYO15A基因突变导致HC样细胞的表型异常和功能障碍。该试验证明了人iPSC产生内耳HC的可行性以及遗传校正对基因突变所致的耳聋具有一定的治疗意义。

体外实验显示iPSC可被诱导产生HC和神经元样细胞。Ishikawa等[47]通过3D培养法诱导iPSC最终分化为神经元，并将iPSC衍生的神经元移植到豚鼠耳蜗。在豚鼠的炎症反应得到适当控制时，移植的谷氨酸能神经元在耳蜗中存活[47]。证实iPSC体外诱导产生的神经元细胞可在体移植成功，但该研究未检测移植成功的神经元是否有助于听功能的恢复。在另一项类似研究中，Gokcan等[48]通过动物实验未发现iPSCs移植具有明显的治疗效果，其通过耳后入路行耳蜗造口术，人为破坏大鼠的内耳结构，并在已受损的耳蜗内注入iPSC；注射iPSC前后分别用ABR评估听功能，并在大鼠处死后提取耳蜗组织观察内耳中iPSC的生物学行为，最终未发现iPSC有明显的治疗作用。

5 其他类型的干细胞

除上述研究较多的干细胞类型外，还有部分所知甚少的干细胞种类，例如：内耳干细胞[49]、成人干细胞[41]、造血干细胞[22]等。内耳干细胞群体(inner ear stem cells)被发现于人胎儿的耳蜗中，这些细胞保留了SC细胞标志物(Nestin，Sox2，Oct4和Rex1)的表达，可以在几个月内快速增殖，通过特殊培养后呈现出SGN和HC细胞的特征[49]。这些干细胞可通过直接整合入受损组织并继续分化后置换受损的HC和SGN细胞，可能有助于恢复内耳感觉细胞及其感觉神经节[41]。目前已用于内耳再生的成人SC有来自骨髓的造血SC、间充质SC和神经元SC。但现有对干细胞的分类标准尚没有统一，所以成人干细胞的研究范围即与MSC、NSC等重合。有关造血干细胞诱导分化成内耳相关细胞方面的研究较少，Okano等[22]发现通过加入生长因子和转录因子Atoh1，骨髓来源的CD133 + SC可以分化为具有HC特征的细胞，然而，分化产生的细胞没有表现出促进听功能恢复的现象。

6 总结与展望

目前研究已发现多种干细胞，如：ESC、MSC、NSC、iPSC等均可以在细胞实验或部分动物实验中表现出分化为耳蜗HC和SGN样细胞，分化后的细胞具有HC和神经细胞的相关特征；部分研究还发现分化的细胞可整合出现类似内耳的组织，因此干细胞诱导分化成内耳相关细胞治疗SNHL值得期待。未来需要着力解决的问题是干细胞类型的选择、干细胞移植的最佳微环境、诱导分化剂及诱导作用时间等。