染色体微阵列技术用于复发性流产病因诊断中的价值评价

黄红丽 何文凤 姜艳华 刘晓瑛 杨小猛

【摘要】 目的：研究染色体微阵列技术（CMA）应用于复发性流产病因诊断中的价值。方法：抽选2017年7月-2019年6月本院收治的自然流产患者60例进行研究，所有患者均流产2次以上，收集患者的胚胎相关组织进行CMA检测，分析检测结果，研究CMA应用于复发性流产诊断中的价值。结果：所有患者中，染色体数目异常40例（66.67%），染色体结构异常3例（5.00%），单亲二倍体1例（1.67%）;所有患者中，发生流产最多孕周为8周前，检出异常患者最多的也为该时期（82.5%），产妇年龄超过35岁，染色体数目异常的发生率更高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：使用CMA技术对产妇的胚胎相关组织进行染色体检查，可以发现复发性流产的危险因素，检测方法比较简便高效，对产妇复发性流产的诊断、生育风险评估以及生育指导功能具有较大的价值，可以在临床工作中规范应用。

【关键词】 复发性流产 染色体微阵列分析 染色体异常 遗传

[Abstract] Objective： To study the value of chromosome microarray technique （CMA） in the diagnosis of recurrent abortion. Method： A total of 60 cases of spontaneous abortion in our hospital from July 2017 to June 2019 were selected for study. All patients had abortion more than twice. The embryo-related tissues of these patients were collected for CMA detection， and the results were analyzed to study the value of CMA in the diagnosis of recurrent abortion. Result： Among all patients， 40 cases （66.67%） had abnormal chromosome number， 3 cases （5.00%） had abnormal chromosome structure and 1 case （1.67%） had single diploid， and the most abnormal patients （82.5%） had abnormal chromosome number before 8 weeks of pregnancy， the maternal age was over 35 years old， and the incidence of abnormal chromosome number was higher， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Chromosome examination of embryo-related tissues of parturient using CMA technology can find out the risk factors of recurrent abortion. The method is simple and efficient， has a great value in the diagnosis， reproductive risk assessment and reproductive guidance function of recurrent abortion， and can be standardized in clinical work.

[Key words] Recurrent abortion Chromosome microarray analysis Chromosome abnormalities Inheritance

First-authors address： Shenzhen City Luohu District Maternal and Child Health Hospital， Shenzhen 518000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.035

復发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指同一性伴侣连续发生3次及以上的自然流产，其发生率为1%～3%，但大多数专家认为连续发生2次流产即应重视并予评估[1-2]。研究与实践表明，患者发生复发性流产次数越多，不孕、月经紊乱以及宫腔粘连等症状的发生率越高，给患者与其家人带来的悲伤与抑郁等负性情绪反应越大[3]。因此，随着对该疾病认识的加深，相关医务工作者对流产次数超过2次以上患者的关注度逐渐加深，临床上一般对该类患者进行合理的评估。研究证明，导致自然流产发生的原因有孕产妇免疫系统功能紊乱、胚胎染色体异常、产妇内分泌功能紊乱、生殖系统发育异常、生殖泌尿系统发生病原微生物的感染以及宫颈生理功能的紊乱与异常，所有原因中最常见的是胚胎染色体异常[4]。因此，采取科学规范的技术手段对胚胎的染色体进行检查对检测与排除复发性流产、指导生育与妊娠具有十分重要的价值[5]。染色体微阵列技术（CMA）是近几年研究出的采用微阵列的技术手段对染色体的数目形态等进行分析的技术[6-7]，该技术可以实现对全基因组的检测与扫描，能够检测出变异程度极小的微重复与微缺失，填补了以往常规检测手段无法检测5 Mb以下基因变异的技术空白，同时该技术操作简便，取材方便，对产妇的伤害较小，诱发感染的可能性比较低[8-9]，因此研究将该技术应用于复发性流产产妇染色体检测中有一定的意义。为了研究该技术应用于复发性流产诊断中的可行性与实际价值，本院特选择收治的复发性流产患者进行此次研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年7月-2019年6月本院收治的复发性流产患者60例进行研究。纳入标准：（1）流产次数≥2次;（2）年龄在20周岁以上;（3）均符合复发性流产的诊断标准;（4）诊断确认胚胎已经停止发育，并经合理评估认定需要施行清宫术治疗。排除标准：（1）合并精神疾病;（2）合并糖尿病、高血压、冠心病等心脑血管疾病;（3）中途退出。60例患者，年龄29～41岁，平均（28.28±1.39）岁;孕周5.33～12.00周，平均（8.46±1.08）周;流产次数2～5次，平均（2.43±1.07）岁。该研究已经伦理学委员会批准，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 材料、试剂与仪器 （1）材料。DNA提取盒（德国Qiagen公司生产），PCR纯化试剂盒、基因工程相关酶类（Nsp I、T4连接酶等）、PCR扩增试剂盒（美国Clontech公司生产）、标记与片段化试剂盒、芯片试剂盒（美国Affymetrix公司生产）。（2）设备。杂交仪、洗涤工作站、扫描仪，均来自美国Affymetrix公司。

1.3 方法 手术前，预先将需要进行样本采集的1.5 mL离心管装入适量生理盐水，在对产妇进行手术过程中，将手术获取的胚胎部位组织用无菌生理盐水冲洗干净，然后使用干净未受污染的手术器械将胚胎的绒毛组织剪下大约80 mg，将剪取的组织放置在事先准备好的离心管内，尽快（不超过1 h）送到实验室进行检测。送入实验室后使用专业的DNA提取试剂盒对组织中的全基因组DNA进行提取，提取完成后，将提取到的DNA取250 ng，使用Nsp I酶进行处理，将其分解为较小的片段，然后把分解产物的尾端补齐，再使用T4连接酶将共同引物连接于分解的片段上，然后将该片段进行PCR扩增以及纯化处理，最后使用标记与片段化试剂盒进行处理，将其同杂交液混匀，经过变性处理后置于芯片试剂盒，然后使用杂交仪杂交16 h左右，注意转速控制在60 r/min，温度为50 ℃，最后杂交后的样品使用洗涤工作站进行处理，将染色洗净，使用扫描仪进行图像的捕获，取得本研究需要的数据。

1.4 结果判读 本研究经过CMA取得的实验数据使用专业数据分析软件进行分析。然后对拷贝数变异（CNV）情况进行分析比较，比较的标准来自DGV、OMIM、DECIPHER以及ISCA等数据库，同时结合查阅的相关专业文献资料，严格解读患者的CNV情况，现阶段的研究认为，CNV可以分成3个不同的等级：（1）致病性;（2）未确定意义;（3）不致病。

1.5 统计学处理 采用SPSS 24.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验与Fisher检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体异常的类型与分布情况 所有患者中异常44例（73.33%），其中染色体数目异常40例（66.67%），染色体结构异常3例（5.00%），单亲二倍体1例（1.67%），见表1。

2.2 异常患者孕周分布情况 所有患者中，发生流产最多孕周为8周之前，检出异常患者最多的也为该时期（82.5%），见表2。

2.3 患者染色体异常的年龄分布 产妇年龄超过35岁，染色体数目异常的发生率更高，差异有统计学有意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

复发性流产指的是连续发生2次及以上的自然流产，产妇大多在妊娠的20周以内发生流产，妊娠终止，发生该病之前最常见的症状有异常阴道出血以及腹部疼痛。现代医学认为，该病与多种因素有关，比较常见的有产妇生殖系统发育异常、胎儿染色体异常以及遭受病原微生物的感染等，其中最常见的致病因素是胎儿发生的染色体异常[10-11]。临床上诊断和治疗该疾病时需要通过规范的体格检查、严谨的生化指标以及相關影像学手段等将该病与异位妊娠、葡萄胎等疾病进行鉴别诊断，同时明确发生复发性流产的具体病因并做出合理干预指导。因此，采取适当的手段明确产妇发生复发性流产的病因具有重要的现实意义。但是以往检测手段复杂多样，缺乏针对性，同时许多检查手段对患者伤害较大，难以被患者接受，因而限制了该病的诊断与治疗。本院考虑采用CMA技术对流产胎儿进行染色体检查，评估该项检查应用的实际价值。

CMA技术是一项遗传学检查技术，该技术可以实现对整体基因组拷贝数的单次、高通量、高敏感性以及高分辨率的检测[12-13]，能够对发生变异的位置以及内在实际基因含量进行精确地定位，同时通过与正常基因组进行比对分析，可以对患者的相关临床症状做出合理解释，对患者的治疗方案以及疾病治疗的预后做出科学评估[14]。因此CMA技术与其他的遗传学检查技术相比，对染色体异常的检出更精确灵敏[15]，对因染色体异常导致的复发性流产患者的临床诊断具有较大的价值，除此之外，还可以对夫妻双方的变异位点进行检测，实现对下一次生育的流产风险评估，效果卓著，具有其他研究方法不具有的优点。

本研究中，所有患者检测均成功，共检测出染色体存在异常患者44例（73.33%），其中染色体数目异常者有40例（66.67%），染色体结构异常3例（5.00%），单亲二倍体者有1例（1.67%）。本结果可以证明，染色体异常是引起复发性流产的最常见原因。所有染色体数目异常患者中，最常见的异常类型是16三体，其次常见的X染色体缺失，另外21三体异常现象的出现比例也比较高，其余异常类型相对而言出现比例较低，这提示在临床工作中要注意以上常见异常类型的排查，如果在患者的流产胚胎中查见非整倍异常现象，那么可以认为导致产妇发生复发性流产的最根本原因是非整倍体异常。针对此现象，建议患者按照科学合理的方式进行自然妊娠，妊娠期间注意做好相关检查与筛查工作，发现异常时及时处置。比较孕周与流产之间关系发现，所有患者中，发生流产最多孕周为8周之前，检出异常患者最多的也为该时期（82.50%），这可能是因为染色体异常在妊娠早期即可导致胚胎停止发育，引起流产，这提示要做好早期妊娠的排查工作，对存在明确流产迹象的产妇按照诊疗规范做出处理。最后，还分析了产妇年龄与染色体异常之间的关系，结果表明，产妇年龄超过35岁以后，染色体数目异常的发生率更高，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，要指导备孕夫妻尽量在合适的年龄妊娠，同时加强对高龄产妇的监测，做好针对此类产妇的临床检查工作，及时排查染色体异常现象。

综上所述，将CMA检查技术应用于自然流产患者的临床诊断中，对该类患者胚胎相关组织进行染色体分析，准确率较高，分辨率较高，可以检出拷贝数很小的变异基因;同时，此种技术操作简单，取材方便，可以提取产妇流产的绒毛组织以及死亡的胚胎相关组织进行检测，对产妇伤害较小，易于被产妇及家人接受。同时在检测时不需要进行培养操作，缩短了等待时间，克服了常规检测手段等待时间长、对患者伤害较大、检测准确率低等缺点，效果显著，减轻了患者受到的伤害，利于排查产妇流产的原因，利于对妊娠进行指导，具有较高的临床应用价值，前景广阔，值得推广。

参考文献

[1]染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用协作组.染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用专家共识[J].中华妇产科杂志，2014，49（8）：570-572.

[2]滕奔琦，范建辉，章钧，等.初次自然流产与复发性自然流产绒毛组织细胞遗传学分析[J].新医学，2011，42（11）：723-726.

[3]陈玉清，裴慧慧，姚书忠，等.不孕症女性患者焦虑抑郁状况及相关因素分析[J].新医学，2013，44（11）：756-760.

[4]季修庆，李璃，林颖，等.應用单核首酸多态性一微阵列比较基因组杂交技术检测胎儿标记染色体[J].中华医学遗传学杂志，2012，29（5）：510-514.

[5]熊佳丽，王晶，董一善，等.染色体微阵列技术在复发性流产病因诊断中的应用[J].中国现代医学杂志，2018，28（31）：37-41.

[6]程丹，杨箐，李洁，等.复发性自然流产胎儿绒毛染色体微阵列芯片327例分析[J].新医学，2018，49（11）：787-792.

[7]宋婷婷，万陕宁，黎早，等.染色体微阵列分析技术在侧脑室增宽胎儿产前诊断中的应用价值[J].解放军医学杂志，2017，42（10）：902-908.

[8]胡婷，张竹，王嘉敏，等.染色体微阵列分析在染色体核型分析无法明确诊断病例中的应用价值[J].四川大学学报（医学版），2017，48（3）：460-463.

[9]张燕，符芳，李茹，等.全基因组高分辨率染色体微阵列分析在超声结构异常胎儿中的应用[J].中华医学遗传学杂志，2015，32（2）：169-174.

[10]罗彩群，刘洋，邓惠敏，等.染色体微阵列分析技术在血清学筛查高风险孕妇中的应用价值分析[J/OL].临床医药文献电子杂志，2019，6（29）：127-128.

[11]章鸯，戴美珍，刘佳媚，等.染色体微阵列分析技术在单脐动脉胎儿中的应用[J].中国优生与遗传杂志，2019，27（3）：342-343，291.

[12] Vogel I，Petersen O B，Christensen R，et al.Chromosomal microarray as primary diagnostic genomic tool for pregnancies at increased risk within a population-based combined first-trimester screening program[J].Ultrasound Obstet Gyneco1，2018，51（4）：480-486.

[13]American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Practice Bulletins-Obstetrics，Committee on Genetics，Society for Maternal-Fetal Medicine.Practice Bulletin No.162：Prenatal Diagnostic Testing for Genetic Disorders[J].Obstet Gynecol，2016，127（5）：108-122.

[14] Wright D，Carey L，Battersby S，et al.Validation of a Chromosomal Microarray for Prenatal Diagnosis Using a Prospective Cohort of Pregnancies with increased hick for Chromosome Abnormalities[J].Genet Test Mol Biomarkers，2016，20（12）：791-798.

[15] Baker J，Shuman C，Chitayat D，et al.Informed Decision-Making in the Context of Prenatal Chromosomal Microarray[J].J Genet Couns，2018，27（5）：1130-1147.

（收稿日期：2019-08-02） （本文编辑：程旭然）