广东惠州地区新生儿5000例应用串联质谱技术筛查遗传代谢病的结果及跟踪随访分析

张志强 赵雨香 曾业熙

【摘要】 目的：观察广东惠州地区新生儿5 000例应用串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MSMS）筛查遗传代谢病的结果，进行跟踪随访分析。方法：选取广东惠州地区新生儿5 000例为研究对象，以MSMS筛查其遗传代谢病，并对确诊病例进行跟踪随访分析。结果：5 000例新生儿中，筛查出阳性106例（2.12%），最后确诊16例，阳性发生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代谢异常10例，有机酸代谢异常4例，脂肪酸代谢异常2例。MSMS筛查灵敏度100%，特异度98.19%，假阳性率1.81%;跟踪随访平均10个月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代谢异常、2例（12.50%）脂肪酸代谢异常及1例（6.25%）有机酸代谢异常]未表现出显著症状;枫糖尿症、戊二酸血症Ⅰ型、甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症者均具有智力发育迟缓与运动能力发育滞后表现;鸟氨酸氨甲酰磷酸转移酶缺乏者产生嗜睡、抽搐症状与高氨血症。结论：MSMS筛查新生儿遗传代谢病灵敏度及特异度均较高，但同时存在一定程度假阳性率，有待进一步改进。

【关键词】 广东惠州 新生儿 串联质谱技术 遗传代谢病

[Abstract] Objective： To observe the screening results of inherited metabolic diseases by tandem mass spectrometry （MSMS） from 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong， and to conduct follow-up analysis. Method： A total of 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong were enrolled as subjects. The inherited metabolic diseases were screened by MSMS. The confirmed cases were followed up and analyzed. Result： Among 5 000 newborns， there were 106 cases （2.12%） positive， and 16 cases finally confirmed， the positive incidence rate was 1︰313. There were 11 males and 5 females， included 10 cases with abnormal amino acid metabolisms， 4 cases with abnormal organic acids metabolism， and 2 cases with abnormal fatty acid metabolism. The sensitivity， specificity and false positive rate of MSMS screening were 100%， 98.19% and 1.81%， respectively. The duration of follow-up was 10 months， there were 12 cases [9 cases （56.25%） with amino acid metabolism abnormalities， 2 cases （12.50%） with fatty acid metabolism abnormalities and 1 case （6.25%） with organic acid metabolism abnormalities] not showed significant symptoms. There were manifestations such as mental development retardation and motor ability retardation in patients with maple syrup urine disease， glutaric aciduria Ⅰ， methylmalonic acidemia with homocysteine. The patients with lack of ornithine carbamoyl phosphate transferase were easily accompanied with drowsiness， convulsions and hyperammonemia. Conclusion： The sensitivity and specificity of MSMS are high for screening neonatal inherited metabolic diseases， but at the same time， there is a certain degree of false positive rate， which needs further improvement.

[Key words] Huizhou， Guangdong Newborn Tandem mass spectrometry Inherited metabolic disease

First-authors address： Huizhou Second Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Huizhou 516001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.021

遺传代谢病主要指因基因突变使得糖、微量元素、蛋白以及脂肪代谢反应中重要载体或者酶分子等缺失导致的疾病，一般是单基因遗传病。现阶段，常见遗传代谢病高达500种，新生儿总体患病率约为1︰3 000，若依据中国每年出生1 500万新生儿进行计算，每年遗传代谢病患儿有5 000例，其中每天新增例数为14例左右[1-3]。该类疾病对新生儿造成严重危害，通常能引起智力障碍，甚至危及生命。早期诊治，特别是症状产生前的有效筛查，对遗传代谢病患儿预后意义重大[4]。当前，日本、美国以及德国等国家已经在遗传代谢病筛查中采取了用串联质谱技术（tandem mass spectrometry，MSMS）。本文以5 000例新生儿为研究对象，探讨MSMS对其遗传代谢病筛查结果及随访情况。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年3月-2018年4月广东惠州地区新生儿5 000例。（1）纳入标准：①新生儿父母为本地常住人口;②活产儿;③家属同意行MSMS筛查。（2）排除标准：可疑阳性，但由于各种原因未参与确诊试验者。其中男2 714例，女2 286例;出生体重1 500～2 500 g 198例，>2 500 g 4 802例;早产儿212例，足月儿4 788例，本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 依据《新生儿疾病筛查技术规范（2010年版）》相关要求，在婴儿出生72 h后，于脚跟内、外侧进行采血，然后滴于903特殊滤纸片待其自然晾干，最后置于2～8 ℃冰箱之中保存，注意于1周内及时送检。

1.2.2 检测方法 采用三重四级杆质谱仪（型号：API 3200MDTM，购自AB Sciex Pte.Ltd）;从干血滤纸中选取圆形滤纸血片，直径长为3 mm，放在96孔聚丙烯板之内，琥珀酰丙酮和非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒及相关质控样品购自广州市丰华生物工程有限公司（注册证号：国械注准20163401324）。对于检测项目，主要为10个氨基酸、24个酰基肉碱及其对应具体比值。

1.2.3 检测数据分析 通过多反应监测扫描方法得到数据，并以配套分析软件处理后得到各目标代谢物具体绝对值浓度。对于截断值确定，需依据10 000例正常新生儿予以截断值计算，规定实验室获取值第0.1以及第99.9个百分位值组成的区间是该实验室指标正常参考水平范围，相关截断值依据样本变化不断修正，如果分析物>截断值，则需重新操作1次，如果仍然较高，则需2～3周复查。MSMS阳性标准：分析物严重高于截断值，立即召回予以再次检查之后，检查结果依然为同一指标严重高于截断值，则可判断为阳性，并归为可疑患者;阴性标准：分析物低于截断值[5]。

1.2.4 可疑患者确诊试验 对MSMS检测阳性者予以血常规、生化、尿有机酸、血糖、血氨、尿酮体、乳酸、丙酮酸以及同型半胱氨酸检查，同时开展血气分析以及基因分析，完成确诊试验。对确诊患儿进行跟踪随访。可疑患者确诊诊断标准：（1）氨基酸代谢异常疾病依据《新生儿疾病筛查技术规范（2010年版）》进行评估：对高苯丙氨酸血症（检测显示血苯丙氨酸水平持续超过120 ?mol/L）予以尿蝶呤谱分析以及二氢蝶啶还原酶（DHPR）分子活性测定予以鉴别诊断，其中高苯丙氨酸血症确定排除BH4缺乏症后，如果血苯丙氨酸水平≥360 ?mol/L，则诊断为苯丙酮尿症，如果血苯丙氨酸水平<360 ?mol/L，则诊断轻度高苯丙氨酸血症。（2）脂肪酸代谢障碍：对于原发性肉碱吸收障碍，需要参考MSMS里面血浆肉碱水平变化情况，若持续明显降低，则可确诊。（3）有机酸代谢障碍疾病通过尿气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）加以明确诊断，戊二酸血症Ⅰ型：戊二酰肉碱增高，并且戊二酰肉碱/辛酰肉碱结果提升，游离肉碱减少，经基因分析，发现GCDH 2个等位基因具有致病突变;甲基丙二酸血症：尿同型胱氨酸检测均显示存在过量含硫氨基酸。

1.3 观察指标 观察总体筛查结果，以确诊结果作为对照，分析MSMS检测准确性、灵敏度与特异度;观察脂肪酸、氨基酸与有机酸代谢异常检出情况，并分析随访情况。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0分析数据，计数资料以率（%）表示。

2 结果

2.1 总体筛查结果 5 000例新生儿中，筛查出阳性106例（2.12%），最后确诊16例，阳性发生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代谢异常10例，有机酸代谢异常4例，脂肪酸代谢异常2例。MSMS筛查灵敏度100%，特异度98.19%，假阳性率1.81%。见表1。

2.2 氨基酸代谢异常 本次确诊患者中，氨基酸代谢异常10例，包括高苯丙氨酸血症5例，精氨酸血症、枫糖尿症、鸟氨酸氨甲酰磷酸转移酶缺乏、瓜氨酸血症以及瓜氨酸血症Ⅱ型患者各1例。

2.3 有机酸代谢异常 本次确诊患者中，有机酸代谢异常4例，包括戊二酸血症Ⅰ型、甲基丙二酸血症、甲基丙二酸合并丙酸血症以及甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患者各1例。

2.4 脂肪酸代谢异常 本次确诊患者中，脂肪酸代谢异常新生儿2例，均存在原发性肉碱吸收障碍。

2.5 跟踪随访分析 16例确诊新生儿，平均跟踪随访时间为10个月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代谢异常、2例（12.50%）脂肪酸代谢异常以及1例（6.25%）有机酸代谢异常]未表现出显著症状。枫糖尿症、戊二酸血症Ⅰ型、甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症者具有智力发育迟缓与运动能力发育滞后表现;鸟氨酸氨甲酰磷酸转移酶缺乏者产生嗜睡、抽搐症状与高氨血症。

3 讨论

遗传代谢病属于对婴幼儿身体健康造成严重危害的疾病，因为疾病种类繁多，新生儿单一疾病发病率不高，在医疗资源较为有限背景下，国家通过进行公共卫生立法，将发病率较高、影响严重、早期发现且给予治疗后可以取得良好预后的相应疾病纳入各地区新生儿群体筛查，同时获得了较为良好社会效益[6-8]。我国各地区由于经济发展、医疗水平以及疾病发生情况均存在差异，需对新生儿遗传代谢病筛查力度与疾病种类予以不同程度增加[9]。

从20世纪60年代Niu等[10]首先实施细菌抑制法进行苯丙酮尿症临床筛查以来，不少国家均已在一定程度上实施了遗传代谢病相关筛查工作。以往常用疾病筛查手段包括時间分辨荧光分析法、细菌抑制法、酶联免疫检测法与荧光法等，只能在1次实验中进行1种疾病检测，但是遗传代谢病属于病种较多疾病，如果使用这些筛查手段，不仅会明显增加工作量，同时还会降低筛查效率。随着医疗技术持续发展，新生儿疾病筛查工作中的病种也逐渐增多，特别是MSMS技术的实施，明显扩展了既往筛查疾病谱，为当前遗传代谢病筛查工作中最理想的一种分析技术[11-15]。质谱基本原理如下：将分析物离子化，使其成为各种带电粒子（具有不同质荷比），通过电磁学原理，将这些带电粒子依据质荷比于空间或者于时间上产生分离，并且排列成图谱，然后按照图谱与离子峰值情况对分析物予以鉴定、定量[16-17]。所谓MSMS，即串联两台质谱仪，其中第1台是分离器，而另1台为分析仪，能够分析分析物解离后各种带电粒子，且其检测水平能够达到pg级，能于几分钟内完成一个样本之中几十个项目的检测，同时所需样本量小。遗传代谢病的出现受胎儿基因与生存环境共同影响，在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）显示，现今已发现遗传代谢病2万余种，包括500种左右的常见病，这种疾病在人类出生缺陷中占非常重要的地位[18-19]。

本次研究对广东惠州地区5 000例应用MSMS筛查的新生儿进行调查分析，发现可疑阳性新生儿106例（2.12%），最后确诊16例[氨基酸代谢异常10例（高苯丙氨酸血症5例，精氨酸血症、枫糖尿症、鸟氨酸氨甲酰磷酸转移酶缺乏、瓜氨酸血症以及瓜氨酸血症Ⅱ型患者各1例），有机酸代谢异常4例（戊二酸血症Ⅰ型、甲基丙二酸血症、甲基丙二酸并丙酸血症以及甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患者各1例），脂肪酸代谢异常2例（原发性肉碱吸收障碍）]，阳性发生率1︰313，与尹峰[20]研究结果相比较高，可能与研究样本量以及地区差异等相关。与确诊结果对照发现，MSMS筛查灵敏度100%，特异度98.19%，假阳性率1.81%，表明MSMS筛查新生儿遗传代谢病具有较高特异度及灵敏度，但亦具有一定程度假阳性率，需要进一步改进。MSMS技术在新生儿遗传代谢病筛查过程中具有很多优势，但其于临床应用中依然存在不少局限性，包括仪器价格昂贵、维护费用相对较高、必须配备熟悉仪器正确使用方式的相应技术人员;同时，检测结果较容易受部分药物或者新生儿体重、孕周与其营养状况等个体因素影响，需临床检查医师综合分析检测结果。因为MSMS筛查的病种通常较少见，需临床专科医生熟悉疾病诊治过程，并对患儿予以定期随访。如果MSMS检测指标显示异常，尚无法明确诊断疾病，需结合患者临床症状以及尿GC-MS等其他检测指标、基因分析、酶活性检测等确诊。对确诊新生儿进行跟踪随访，发现其预后情况为：9例氨基酸代谢异常、2例脂肪酸代谢异常以及1例有机酸代谢异常者并未产生明顯症状，而其他患者则产生智力发育迟缓、身体运动发育滞后、高氨血症、嗜睡以及抽搐等表现。

综上，在新生儿遗传代谢病筛查中采取MSMS方法，筛查结果灵敏度与特异度非常高，但因存在一定程度假阳性率，故有待进一步改进，该筛查方式可在一定程度上改善患者预后，具有推广与普及意义。

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（收稿日期：2019-04-22） （本文编辑：程旭然）