骨髓间充质干细胞移植在儿童肾病综合征鼠模型中的实验研究

黄青 凌志杰 邹毓华 钟小明 杨赟 张明海 罗开源

【摘要】 目的：觀察骨髓间充质干细胞（BMSCs）在儿童肾病综合征（NS）鼠模型中作用，探讨BMSCs移植治疗儿童NS的可能性。方法：分离、纯化、扩增和鉴定BMSCs。21日龄刚断奶的SD大鼠适应性喂养后，筛选尿蛋白浓度<0.8 g/L作为实验用鼠。随机选取5只实验用鼠作为正常对照称A组，其余实验鼠按照Bertani法尾静脉注射盐酸阿霉素制作MCNS鼠模型。成模后随机分成B、C、D组，每组5只，分别按计划注射生理盐水、泼尼松灌胃和注射BMSCs细胞悬液。各组大鼠按计划进行24 h尿蛋白定量和血肌酐检测。结果：造模前，各组24 h尿蛋白和血肌酐水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;造模后，B、C、D组24 h尿蛋白和血肌酐水平均升高，且A组24 h尿蛋白和血肌酐水平均低于其他三组（P<0.05）;干预后1、4、8周，B、C、D组24 h尿蛋白和血肌酐水平均持续升高，C、D组24 h尿蛋白和血肌酐水平均低于B组（P<0.05），且D组干预后8周血肌酐水平低于C组（P<0.05）。结论：BMSCs移植可改善阿霉素诱导的肾损伤，降低蛋白尿和血肌酐水平。

【关键词】 骨髓间充质干细胞 肾病综合征 阿霉素

[Abstract] Objective： To observe the role of bone mesenchymal stem cells （BMSCs） in the rat model of nephrotic syndrome （NS） in children， and to explore the possibility of BMSCs transplantation in the treatment of NS in children. Method： Separation， purification， amplification and identification of BMSCs. After adaptive feeding of 21-day-old newly weaned SD rats， urinary protein concentration <0.8 g/L was selected as experimental rats. Five experimental mice were randomly selected as control group A. The other experimental mice were injected adriamycin hydrochloride into tail vein according to Bertani method to make MCNS mice model. The rats were randomly divided into groups B， C and D， with 5 rats in each group， and they were given normal saline injection， Prednisone intragastric administration and BMSCs cell suspension injection respectively according to the plan. The 24-hour urinary protein and serum creatinine were measured in each group. Result： Before modeling， there were no significant differences in 24-hour urinary protein and serum creatinine levels among the groups （P>0.05）. After modeling， 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups B， C and D increased， and 24-hour urinary protein and creatinine levels in group A were lower than those in other three groups （P<0.05）. At 1， 4 and 8 weeks after intervention， the 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups B， C and D increased continuously， while the 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups C and D were lower than those in group B （P<0.05）， the serum creatinine level in group D was lower than that in group C after intervention 8 weeks （P<0.05）. Conclusion： BMSCs transplantation can ameliorate adriamycin-induced renal injury and reduce the levels of proteinuria and creatinine.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells Nephrotic syndrome Adriamycin

First-authors address： First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.010

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是儿童泌尿系统的常见病，多为原发性，微小病变型居多[1]。微小病变型肾病综合征（minimal change nephrotic syndrome，MCNS）病因不明，目前儿科临床多采用以糖皮质激素为主的综合治疗。儿童正处于生长发育关键期，大量蛋白尿和长期服用激素等药物会影响患儿的生长发育和心身健康。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有增殖、分化、分泌和免疫调节等功能。近年来有研究发现，BMSCs在损伤修复、再生、免疫调节等方面具有重要作用[2]。本研究采用体外扩增的大鼠BMSCs经尾静脉途径注入阿霉素诱导MCNS鼠模型体内，观察其疗效并探索其可能作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 BMSCs提取及鉴定 60～80 g雄性SD大鼠（购于赣南医学院动物实验中心）颈椎脱臼处死，取出双股骨和胫骨。PBS冲洗骨髓腔，经大鼠淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用贴壁法纯化培养BMSCs。培养基为含10%胎牛血清（Hycolne），100 U/L青、链霉素，2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM-LG（Hycolne）完全培养基。BMSCs鉴定：（1）表型。P5代对数生长期的BMSCs，按试剂盒说明书要求加入抗体（Biolegend），避光孵育，充分洗涤后制成单细胞悬液后用流式细胞仪检测。（2）分化。P5代对数生长期的BMSCs种板后，用成脂和成骨诱导液培养（成脂诱导剂包括DMEM-HG、10%胎牛血清、10-6 mol地塞米松、0.5 mmol 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 μg/mL胰岛素、0.2 mmol吲哚美辛;成骨诱导剂包括DMEM-HG、10%胎牛血清、10-7 mol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C;主要试剂均购于Sigma）。成脂诱导2周、成骨诱导3周后分别进行油红O和Von Kossa 染色[3]。

1.2 造模与分组 断奶日龄21 d的雄性SD大鼠，平均体重（40.0±8.5）g，适应性喂养7 d，测尿蛋白值<0.8 g/L者作为实验用鼠。随机抽取5只实验用鼠作为正常对照命名为A组，其余实验用鼠按Bertani法进行造模[4]。盐酸阿霉素粉针剂10 mg（辉瑞制药）用生理盐水配成2 mg/mL的溶液，非麻醉下尾静脉一次性按7.5 mg/kg剂量注射阿霉素，14 d后尿蛋白定量>30 mg/24 h表示造模成功，认定为NS模型鼠并随机分成B、C、D组，各5只。

1.3 实验各组干预 将P4～P5代BMSCs，配成浓度约1×106个/mL的细胞悬液，在D组（干细胞治疗）大鼠成模后的第2天和第8天分别经尾静脉注射2 mL BMSCs悬液[内含（1～2）×106个BMSCs];与D组干预相同时间，A组（正常对照）、B组（空白对照）大鼠经尾静脉注射等量生理盐水;C组（激素治疗）大鼠在成模后第2天开始给予泼尼松5 mg/（kg·d）灌胃给药，连续给药8周。

1.4 标本收集与检测

1.4.1 尿标本收集及检测 将实验鼠置入代謝笼中，代谢笼下置干净空瓶。为防止尿液变质，空瓶中预先加入1 mL的甲醛。24 h后，收集尿液送检验科测量尿液总体积和尿蛋白浓度，计算得出24 h尿蛋白量。收集次数与时间如下，第一次：购买回SD大鼠适应性培养第7天;第二次：模型鼠注射阿霉素第14天;第三次：以D组干细胞治疗首次干预后第1周;第四次：以D组干细胞治疗首次干预后第4周;第五次：以D组干细胞治疗首次干预后第8周。

1.4.2 血标本收集及血肌酐的检测 用乙醚麻醉后，经眶静脉采血用抗凝管收集，立即送至检验科检测血肌酐水平。采血次数与时间如下，第一次：造模鼠注射阿霉素第14天;第二次：以D组干细胞治疗首次干预后第1周;第三次：以D组干细胞治疗首次干预后第4周;第四次：以D组干细胞治疗首次干预后第8周。

1.5 统计学处理 使用SPSS 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs培养与纯化 原代培养的BMSCs贴壁生长，呈星形或多角形，含有一定量的悬浮圆形杂质细胞，见图1;经传代培养，杂质细胞逐渐减少变纯、BMSCs大量扩增;传至P3代时，镜下观察几乎未见悬浮培养的杂质细胞，见图2。

2.2 BMSCs表型鉴定结果 P5代对数生长期的BMSCs经用流式细胞仪检测后，BMSCs表型为CD90+、CD29+、CD45-、CD34-，其中CD90、CD45、CD34、CD29阳性细胞群的荧光吸收峰分别为98.2%、1.32%、1.01%、99.1%，见图3。

2.3 BMSCs分化结果 成脂诱导2周进行油红O染色，结果阳性可见染成红色的脂肪细胞，见图4;成骨诱导3周后进行Von Kossa染色，结果阳性可见成骨细胞包浆内有黑色物质沉淀物，见图5。

2.4 各组24 h尿蛋白比较 造模前，各组24 h尿蛋白比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;造模后，B、C、D组24 h尿蛋白均数高于30 mg/24 h，B、C、D组的组间两两比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但A组24 h尿蛋白均低于其他三组（P<0.05）;干预后1、4、8周，B、C、D组24 h尿蛋白均持续升高，C、D组24 h尿蛋白均低于B组（P<0.05），但C、D组24 h尿蛋白比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图6、表1。

2.5 各组血肌酐水平比较 造模前，各组血肌酐水平比较，差异无统计学意义（P>0.05 ）;造模后，B、C、D组血肌酐水平均升高，B、C、D组的组间两两比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但A组血肌酐水平均低于其他三组（P<0.05）;干预后1、4、8周，B、C、D组血肌酐水平均持续升高，C、D组血肌酐水平均低于B组（P<0.05）;干预后1、4周，C、D组血肌酐水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05），干预后8周，D组血肌酐水平低于C组（P<0.05）。见图7、表2。

3 讨论

NS是由多原因引起的肾小球基底膜通透性增高，导致大量血浆蛋白从尿中丢失的一种临床综合征，以大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和水肿为主要临床表现[5-6]。儿童NS以微小病变型居多，多为3～5岁的学龄前儿童。MCNS的病理表现为：光镜下肾小球基本正常，电镜下弥漫性肾小球脏层上皮细胞足突消失[7]。目前认为MCNS发病主要与肾小球滤过膜静电屏障减弱或消失有关，使带负电荷的白蛋白大量漏出形成蛋白尿。

阿霉素是一种含醌式结构具有抗肿瘤作用的抗生素，在体内酶的作用下可形成半醌型自由基。半醌型自由基氧化反应后可生成活性氧物质，诱发肾小球上皮系部脂质过氧化，破坏肾小球滤过膜，导致屏障功能障碍从而引起蛋白尿。阿霉素NS鼠模型于1982年Bertani等率先报道，具有造模简便、成功率高、稳定性好等优点，是公认较好MCNS鼠模型[8]。本实验采用Bertain法，尾静脉一次性大剂量（7.5 mg/kg）注射盐酸阿霉素进行造模，注射后14 d后尿蛋白定量均>30 mg/24 h，成模率达100%。

BMSCs是一类来自骨髓的多能干细胞，具有大量增殖、多向分化、旁分泌、免疫调节、低免疫源性和损伤修复等功能，是组织工程的理想种子细胞。目前研究发现，BMSCs在体外诱导培养下可分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞等[9-11]。本实验通过体外诱导培养，成功诱导BMSCs分化成骨细胞和脂肪细胞。BMSCs在培养中可分泌多种细胞因子，如胰岛素样生长因子-1、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子等[12-15]。Zhuo等[16]在BMSCs移植治疗孤立肾缺血再灌注鼠模型的实验中发现：BMSCs可通过调节抗氧化/氧化平衡来改善缺血再灌注导致的肾损伤。Yang等[17]在BMSCs移植治疗局灶节段性肾小球硬化鼠模型的实验中发现：BMSCs移植可能通过上调MMP/TIMP和下调IL-6、TNF-α来降低尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平。Jiao等[18]在体内外实验中发现：BMSCs移植能通过激活Wnt/β-Catenin通路减少顺铂诱导的肾损伤。

在本实验采用尾静脉注射的方式将BMSCs移植入阿霉素诱导的MCNS鼠模型体内，通过比较同期各组大鼠24 h蛋白尿定量和血肌酐水平观察疗效，结果显示，BMSCs移植和激素均能降低MCNS鼠模型的蛋白尿和血肌酐水平，且差异均有统计学意义（P<0.05）。BMSCs移植能改善阿霉素诱导的MCNS鼠模型肾损伤且无长期使用激素引起的感染、代谢异常等并发症。吴悠等[19]研究发现阿霉素诱导的MCNS模型鼠Th17/Treg免疫失衡程度与肾脏损伤成正比，早期应用泼尼松可通过下调腎脏局部Th17水平保护肾脏。刘倩等[20]发现脂肪干细胞移植能减轻阿霉素诱导的NS鼠模型蛋白尿水平。根据实验结果和文献报告，本课题认为，干细胞可能通过其免疫调理作用保护阿霉素诱导的MCNS模型鼠的肾损伤。

综上所述，BMSCs移植可改善阿霉素诱导的MCNS模型鼠的肾损伤，降低蛋白尿和血肌酐水平，其具体机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2019-07-22） （本文编辑：董悦）