利用具有抑制霉菌活性的植物乳杆菌生产Cheddar干酪

任志敏，忻胜兵，徐娜，薛惠君，陈忠军*

1(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特，010018) 2(北京师范大学 附属实验中学，北京，100032)

Cheddar干酪起源于16世纪的英国切达郡，是一种硬质全脂干酪，其色泽乳白或浅黄，形状大多数呈现鼓状，外层具有天然的布状外壳，具有细腻的口感和柔和的口味[1-2]。随着时代的发展，Cheddar干酪已经传播到世界各地，尤其在欧美国家广泛被生产和食用，因其口味相对温和，在国内也备受欢迎[3]。

随着干酪工艺的不断发展，产品的防腐与贮藏的问题也变得备受关注。天然防腐剂具有安全性高、高效以及不破坏产品原有品质等优势，必将逐步代替化学防腐剂[4-5]。乳酸菌作为一种天然防腐剂，其代谢产物可以抑制致病菌和腐败菌的生长繁殖，可有效延缓产品腐败变质，延长产品的货架期[6]。本研究对分离自内蒙古传统食品中的植物乳杆菌SDZ的抑霉菌活性进行了探究，并对添加该菌株生产Cheddar干酪的工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料乳

原料乳为益得乳品厂提供的新鲜牛乳。

1.1.2 菌株

发酵用菌：嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亚乳酸杆(Lactobacillusbulgaricus)(内蒙古农业大学发酵工程实验室)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SDZ(分离自内蒙古传统发酵食品)。

指示菌：黄曲霉、毛霉、黑曲霉、青霉、娄地青霉、地霉、寄生曲霉(中国微生物菌种保藏管理中心)。

1.1.3 试验主要试剂

CaCl2、NaCl、柠檬酸氢二铵、凝乳酶：上海国药集团化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨、细菌性蛋白胨，酵母提取粉、琼脂：广东环凯微生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4、MnSO4：天津市永大化学试剂开发中心；无水葡萄糖：鸿之惠商贸有限公司。

1.1.4 培养基

MRS培养基：细菌学蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、K2HPO42 g/L、Tween80 1 g/L、MgSO4200 mg/L、MnSO454 mg/L、无水葡萄糖20 g/L，pH值6.5，121 ℃下灭菌20 min。

脱脂乳培养基：脱脂乳粉100 g/L，酵母粉5 g/L，115 ℃下灭菌7 min。

PDA培养基：马铃薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，氯霉素0.1 g，pH 6.0，121 ℃下灭菌20 min。

水琼脂培养基：琼脂15 g/L，121 ℃下灭菌20 min。

1.2 主要仪器与设备

SW-CJ-1FD超净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；RV-10旋转蒸发仪：艾卡(广州)仪器设备有限公司；SHB-Ш循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；KDC-140HR高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；GHP隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LDZX全自动高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；浦春JY系列电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；XH-C漩涡混匀器：常州未来仪器制造有限公司；PHS-3型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；QTS25质构仪：深圳市科兴精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SDZ代谢产物抑菌谱的建立

1.3.1.1 指示菌悬液的制备

将指示菌在PDA斜面划线后28 ℃培养7 d，在斜面上加入5 mL生理盐水，在漩涡仪上振荡均匀，过滤菌丝，收集孢子悬液。利用血球计数板将孢子的浓度调节到106个/mL，备用[7]。

1.3.1.2 制备SDZ代谢产物

将SDZ冻干菌粉接种到MRS培养基中活化。取5 mL活化后的菌液到100 mL MRS培养基中进一步扩大培养。在37 ℃下培养24 h后，取菌液在4 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，利用旋转蒸发仪浓缩20倍，得到SDZ代谢产物。

1.3.1.3 抑菌活性的测定

以霉菌为指示菌，采用牛津杯法测定植物乳杆菌SDZ的抑霉菌活性。将融化好的水琼脂培养基倒入平板中，待琼脂凝固后，在培养基上层放入牛津杯。之后将制备的指示菌悬液加入45 ℃的PDA培养基，倒在水琼脂培养基上。待PDA培养基凝固后，在牛津杯中加入300 μL制备的SDZ代谢产物浓缩液，在28 ℃下培养48 h，测量抑菌圈的直径(含牛津杯直径)[8]。

1.3.2 Cheddar干酪制作工艺

原料乳→巴氏杀菌(63 ℃，30 min)→冷却→添加发酵剂→静置培养→加凝乳酶(按1 g/10 kg添加)→中速搅拌(5 min)→保温(32 ℃)→明显凝乳→切割→热烫(45 min内升温至39 ℃缓慢搅拌)→排乳清→堆酿(至排出乳清pH值为5.4)→搅碎→加盐搅拌→压榨→包装

1.3.3 Cheddar干酪感官评价标准

邀请15位有经验的评委组成感官评分小组，根据Cheddar干酪的整体风味、组织状态和色泽进行综合评定，评定时采用百分制，取平均数作为最终分数[9-10]。感官评分标准如表1所示。

表1 干酪感官评分表Table 1 The scoring criteria of cheese sensory evaluation

1.3.4 添加抑制霉菌特性乳酸菌生产Cheddar干酪工艺研究

1.3.4.1 菌种接种比例对Cheddar干酪感官评分的影响

将活化好的嗜热链球菌、保加利亚乳酸杆菌和植物乳杆菌SDZ菌株按照1∶1∶0.25、1∶1∶0.5、1∶1∶0.75、1∶1∶1和1∶1∶1.25的混合比例，以投放量为3%接种于原料乳中，在34 ℃下发酵30 min，根据感官评分确定最佳接种比例。

1.3.4.2 接种量对Cheddar干酪感官评分的影响

按照上述试验确定的最佳菌种接种比例将活化好的菌株，分别以接种量1%、2%、3%、4%和5%投放到原料乳中，在34 ℃下发酵30 min，根据感官评分确定植物乳杆菌SDZ最佳接种量。

1.3.4.3 发酵温度对Cheddar干酪感官评分的影响

以最佳菌种比例，将活化好的菌株以确定的最佳接种量投放到原料乳中，分别在28、31、34、37、40 ℃下发酵30 min，根据感官评分确定最适发酵温度。

1.3.4.4 发酵时间对Cheddar干酪感官评分的影响

将活化好的菌株按照最佳的接种比例和接种量，在最适发酵温度下分别发酵15、20、25、30、35 min，根据感官评分确定最佳发酵时间。

1.3.4.5 通过响应面分析确定Cheddar干酪最佳工艺

依据单因素试验结果，对接种比例、接种量、发酵温度和发酵时间4个影响因素，利用Design Expert 8.0.6软件设计模型开展响应面分析，获取最适工艺参数。

1.3.5 干酪理化指标测定方法

1.3.5.1 蛋白质测定

依据GB/T 5009.5—2016中的方法对产品中的蛋白质含量进行测定[11]。

1.3.5.2 脂肪测定

将干燥后的干酪进行研磨，放于滤纸中进行抽提，在抽提管内加入无水乙醚至1/3，6～12 h后取下接收瓶，将滤纸放于干燥箱内进行干燥，称量测定脂肪含量[12]。

1.3.5.3 水分测定

依据GB 5009.3—2016中的方法测定产品中水分[13]。

1.3.6 干酪的TPA测定

用QTS25质构仪测定样品的硬度、弹性、凝聚性、胶着性、咀嚼性，回复性，每组样品反复测定3次，取其平均值。质构仪具体参数设定为：探头类型为P/50；测量前探头下降速度为5.0 mm/s；测试速度为1.0 mm/s；下压变形为50%；触发力为0.2 N；

1.3.7 防腐效果的验证

1.3.7.1 防腐效果

将在最佳工艺条件下添加SDZ生产的Cheddar干酪，与传统菌株生产的Cheddar干酪25 ℃裸露放置贮藏。测定干酪成品的霉菌数，每天连续记录产品中的霉菌数，从而获得菌落数指标，观察其防腐效果[14]。

1.3.7.2 成品干酪中霉菌计数方法

根据GB 4789.15—2016中的方法对霉菌进行计数[15]。

1.3.8 数据处理方法

采用SPSS 19.0对试验数据进行处理分析，数据表示方式为(平均数±方差)，作图工具为Origin 7.5。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌SDZ的抑菌谱

植物乳杆菌SDZ的抑菌谱试验结果如表2所示。SDZ对毛霉、黄曲霉和黑曲霉抑菌效果较好；对青霉也具有良好的抑制作用；对娄地青霉和寄生曲霉抑制效果一般；对地霉无抑制作用。综上可知，SDZ对于霉菌有较为广谱的抑菌性。

表2 抑菌谱Table 2 Antifungal spectrum of strains

注：“+”表示抑菌圈直径介于7～10 mm；“++”表示抑菌圈直径介于10～15 mm；“+++”表示抑菌圈直径介于15～18 mm；“++++”表示抑菌圈直径大于18 mm；“-”表示无抑菌效果。

2.2 菌种接种比例对Cheddar干酪感官评分的影响

将活化好的嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌SDZ按照不同的比例添加到原料乳中，对制作好的干酪进行感官评定，结果如图1所示。

图1 不同接种比例对干酪感官评分的影响Fig.1 Effect of mixed proportion of different strains sensory evaluation of cheese

由图1可知，不同接种比例对干酪产品的感官评分影响很大。在嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌SDZ的比例为1∶1∶0.5时，制作出的干酪具有良好的感官评分，明显高于其他接种比例的组分。

2.3 接种量对Cheddar干酪感官评分的影响

将发酵菌株以最佳接种比例，分别添加不同的量制作干酪，并进行感官评定，结果如图2所示。

图2 不同接种量对干酪感官评分的影响Fig.2 Effect of different inoculation amount of strain on sensory evaluation of cheese

从图2可以看出，不同接种量对干酪感官评分影响显著，发酵菌株添加量为3%时，所得干酪的感官评分明显高于其他组分。

2.4 发酵温度对Cheddar干酪感官评分的影响

采用最佳的接种比例和接种量，分别在不同温度下发酵制作干酪，并对所得干酪进行感官评定，结果如图3所示。

图3 不同发酵温度对干酪感官评分的影响Fig.3 Effect of different temperature on the sensory evaluation of cheese

从图3可以看出，40 ℃所得干酪与37 ℃所得干酪感官评分明显高于其他组分，且两者相差无几，但考虑到生产实际和成本，采用37 ℃作为最佳发酵温度。

2.5 发酵时间对Cheddar干酪感官评分的影响

采用最佳的接种比例、接种量和发酵温度，分别在不同的时间下制作干酪，然后对产品进行感官评定，结果如图4所示。

图4 不同发酵时间对干酪感官评分的影响Fig.4 Effect of different fermentation time on the sensory evaluation of cheese

从图4可以看出，随着发酵时间的延长，产品的感官评分逐渐升高，在25 min时达到最高，随着发酵时间的继续延长，感官评分反而会下降。

2.6 响应面法优化Cheddar干酪制作工艺

2.6.1 响应面优化结果

依据单因素试验分析结果，以感官评分(Y)为响应值，采用Design Expert 8.0.6设计四因素三水平的Box-Behnken试验。响应面模型因素与水平设计见表3。Box-Behnken试验设计与结果如表4所示。

表3 响应面试验因素水平表Table 3 Factors and their levels of response surface design

表4 Box-Behnken试验设计与结果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

2.6.2 回归方程的建立

利用Design Expert 8.0.6统计分析软件，对所得4个因素拟合得到感官评定评分(Y)的回归方程为：

Y=94.30+0.11A+0.86B-0.33C+0.37D-2.33AB-1.00AC-1.70AD-4.75BC-2.75BD-4.95CD-6.38A2-5.36B2-6.60C2-6.07D2

2.6.3 方差分析

应用回归分析对方程和方程的各因子进行方差分析，分析结果如表5所示。

注：“**”表示极显著(p<0.01)；“*”表示显著(0.01

从表5中可知，接种比例、接种量、发酵温度和发酵时间对干酪感官评分影响极显著(各二次方项p<0.01)。接种比例与接种量、接种量与发酵温度、接种量与发酵时间、发酵温度与发酵时间的交互作用极显著(p<0.01)，接种比例与发酵时间的交互作用显著(0.010.05)。

2.6.4 响应面分析及优化

考虑在某两个因素固定在中心值不变的条件下，另外两个因素的交互作用对Cheddar干酪感官的影响，绘制出三维立体响应曲面。结果如图5所示。

图5 接种比例、接种量、温度、时间交互作用对 感官评分影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mixed proportion of different strains， Inoculation amount，temperature and fermentation time

从图5可以看出，AC之间交互作用对于感官评分影响不显著(等高线接近圆形)，其余各因素之间两两交互作用对感官评分的影响显著(等高线为椭圆形)，各因素之间两两交互作用对感官评分的影响强度由强到弱依次为：BC>CD>BD>AB>AD>AC，这与方差分析的结果是一致的。

通过该回归方程求解优化后的最佳工艺参数为：接种比例为1∶1∶0.61，接种量为2.98%，发酵温度为36.90 ℃，发酵时间为24.80 min，此条件下干酪成品的感官评分可达91.177 4分。经过验证试验，此条件下生产干酪的感官评分平均为(92.30±0.83) 分，接近于预测分数，说明模型可以较好地预测实际情况。

2.7 干酪成品理化指标的测定结果

取最优条件下生产的干酪进行理化指标的鉴定，结果见表6。

表6 理化指标测定结果Table 6 The results of physical and chemical indicators

注：小写字母不同表示组分间差异显著(p>0.05)。

由表6可以看出，添加植物乳杆菌SDZ生产的干酪与添加传统菌株生产的干酪水分含量、蛋白质含量差异显著。由此可以看出添加植物乳杆菌SDZ不会对干酪的理化指标产生较大影响。

2.8 干酪成品TPA测定结果

将在最佳工艺条件下生产的干酪进行质地剖面分析(texture profile analysis, TPA)测定，结果见表7。

表7 TPA测定结果Table 7 The results of TPA measurement

注：小写字母不同表示组分间差异显著(p>0.05)。

由7表可以看出，添加植物乳杆菌SDZ在最优工艺条件下生产的干酪硬度适中，弹性好，内聚性良好，胶着性和黏性良好，咀嚼性和回复性都优于传统菌株生产的干酪。

2.9 抑菌效果研究

将最佳工艺下生产的Cheddar干酪，与传统菌株生产的Cheddar干酪，在25 ℃下裸露放置，霉菌数测定结果如表8所示。

表8 25 ℃裸露放置干酪成品中霉菌数(CFU/g)测定Table 8 The results of mold populations by exposed treatment during storage at 25 ℃

注：小写字母不同表示组分间差异显著(p>0.05)；“-”表示霉菌生长过于多且连成一团，不可计数。

从表8可以看出，传统菌株发酵生产的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置2 d后，霉菌数就已经超出国标的要求(国标规定霉菌数不得超过50 CFU/g)，而添加SDZ生产的Cheddar干酪在25 ℃下裸露放置5 d后，霉菌数才超标。试验结果表明，与添加传统菌株生产的Cheddar干酪相比，添加SDZ可以有效抑制Cheddar干酪的霉菌污染，从而延长产品的贮藏期。

3 结论

植物乳杆菌SDZ对于霉菌有较为广谱的抑菌性。添加SDZ生产Cheddar干酪的最佳工艺参数为：接种比例1∶1∶0.61，接种量2.98%，发酵温度36.90 ℃，发酵时间24.80 min，在此工艺参数下所得产品硬度适中，弹性好，内聚性适中，胶黏性良好，感官评分明显优于对照组。产品的蛋白质含量为15.3%，脂肪含量为22.4%，水分含量为46%，与传统菌株生产的干酪差别不大。产品在25 ℃下敞口放置霉菌超标的日期高于传统菌株发酵制得干酪，表明添加植物乳杆菌SDZ可以有效延长干酪的保质期。