超声波辅助酶解制备东海海参胶原蛋白低聚肽及其活性的研究

徐红萍，谢 辉，梁建灏，尹 啸，金火喜

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

东海海参（海地瓜，Acaudina molpadioides），是我国20多种可供食用的海参之一，盛产于东海海区，特别是宁波、舟山沿海一带有广泛分布。东海乌参营养价值与药用价值与北方刺参类似[1]，富含蛋白质、海参皂苷、海参多糖、胶原蛋白等成分。然而，由于缺乏产业化关键技术，东海海参市场价格低下，有些甚至在捕捞后被直接作为废弃物丢弃。

东海海参体壁中含有丰富的胶原蛋白，具有良好的生物活性及生物功能。然而，由于其分子量很大，不利于肠胃和皮肤的吸收，限制其生物活性的发挥。因此，人们把目光投向了小分子的胶原蛋白多肽。胶原蛋白多肽不仅具有抗氧化、降血压、抗菌和抗肿瘤等生物活性[2-3]，而且易于消化吸收，食用安全。海参胶原蛋白肽是天然的抗氧化剂，对超氧阴离子（O2·-）、羟基自由基（·OH）等均能有效地清除。研究表明，海参胶原蛋白肽抗氧化性的强弱与蛋白肽的分子量有关，表现出分子量越小，抗氧化活性越强的规律[4]。如不同分子量海地瓜蛋白肽中，分子量小于3 kDa的组分抗氧化活性最强，随着多肽分子量的增加，抗氧化活性逐渐减弱[5]；不同分子量范围的东海海参胶原蛋白肽中，分子量小于5 kDa的组分自由基清除率最大，达90%以上[6]。然而，东海海参体壁的肌纤维丝较粗壮，排列凌乱，纤维丝排列紧密，传统的酶解方法水解度低、产品分子量分布宽、低聚肽含量较低[7-8]。

据此，本文以东海海参胶原蛋白为原料，在超声波的辅助下进行酶解制备低聚肽（分子量Mw＜1 kDa），并研究该低聚肽的抗氧化活性，为东海海参资源的开发与利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

东海海参（浙江省舟山市京洲水产食品有限公司），碱性蛋白酶（≥2 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；木瓜蛋白酶（≥2 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胃蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；中性蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胰蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司），牛血清蛋白（生工生物工程（上海）股份有限公司），其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

粉碎机（BRS-200、安徽博进化工机械有限公司），高速离心机（TGL-16M、上海卢湘仪离心机仪器有限公司），冷冻干燥机（FD-1C、北京德天佑科技发展有限公司），过滤仪（MSC300、上海摩速科学器材有限公司），超滤膜（MSC80005、上海摩速科学器材有限公司），超声波仪器（XH-300A、北京祥鹄科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 东海海参胶原蛋白的提取

东海海参样品用水冲洗，去除泥沙、内脏后，切成小块，用0.2 M EDTA（pH 8.0）浸泡搅拌2 d，每12 h更换溶液。水洗后，用匀浆机匀浆20 min，离心后加入10倍体积的0.1 M Tris-HC（lpH 8.0），搅拌提取48 h。离心后加入10倍体积的0.1 M NaOH搅拌48 h，每12 h更换溶液，除去非胶原物质,10 000 r/min离心15 min。弃去上清液，沉淀物加10倍体积的0.5 M醋酸浸泡48 h，每12 h更换溶液，纱布过滤除去不溶杂质。滤液在蒸馏水中透析48 h，透析液冷冻干燥即得胶原蛋白。

1.3.2 东海海参胶原蛋白低聚肽的制备

称取0.2 g胶原蛋白于20 mL缓冲液中，加入0.1%（w/v）碱性蛋白酶酶解0.5 h，10 000 r/min离心15 min，收集上清液，在超声波辅助下（功率50、100、150、200、300 W），分别加入木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶10 mg水解30 min，得酶解液A。依次选取截留分子量为5 kDa和1 kDa的超滤膜对酶解液A进行超滤处理，得酶解液B。将酶解液B冷冻干燥，即得东海海参胶原蛋白低聚肽干粉。

1.3.3 低聚肽含量测定

采用福林酚试剂法测定酶解液中多肽的含量。配制一系列梯度的牛血清蛋白（BSA）标准溶液，以水作参比，分别与福林酚试剂反应30 min，500 nm下测定吸光度，绘制标准曲线。将酶解液A和B按照相同步骤进行操作，再由标准曲线求解得出多肽含量。

低聚肽含量（%）=酶解液B中的蛋白含量/酶解液A中的蛋白含量×100低聚肽得率（%）=酶解液B冻干粉克数/0.2×100

1.3.4 DPPH清除率测定

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配置成浓度为0.04 mol/mL的溶液。向1 mL样品溶液中加入2 mL DPPH溶液混合均匀，避光室温下放置30 min后，5 000 r/min离心5 min，取上清液，517 nm处测吸光值。

A0：1 mL H2O+2 mL DPPH溶液+1 mL无水乙醇；

A1：1 mL样品+2 mL DPPH溶液+1 mL无水乙醇；

A2：1 mL样品+2 mL无水乙醇+1 mL无水乙醇。

1.3.5 ABTS清除率测定

取440 μL浓度为140 mM的过硫酸钾溶液与25 mL浓度为7 mmol/L的ABTS+的溶液两者混合避光反应14 h，用甲醇稀释到吸光度为0.7±0.002作为工作液。取0.15 mL样品溶液，加入2.85 mL ABTS自由基工作液混合避光反应10 min，734 nm处测吸光值。

A溶剂：为2.85 mL ABTS溶液与0.15 mL甲醇混合后吸光度；

A样品：为2.85 mL ABTS溶液与0.15 mL样品混合后吸光度。

2 结果与讨论

2.1 超声波功率对东海海参胶原蛋白酶解的影响

本试验采用超声波辅助法酶解东海海参胶原蛋白，分别考察了超声波功率对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解东海海参胶原蛋白的影响。

超声波辅助对木瓜蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响如图1，可以看出超声波辅助对木瓜蛋白酶酶解海参胶原蛋白有显著效果，其低聚肽含量和收率均有明显上升。当功率为150 W时，低聚肽收率达到最大，比无超声波辅助提高了32.2%。低聚肽含量峰值出现在200 W，比无超声波辅助提高了82.3%。当超声波功率加大到300 W时，收率和含量分别为24.7%和66.1%。

图2结果显示，超声波辅助对胃蛋白酶水解海参胶原蛋白也有明显的促进效果，低聚肽含量和收率均有显著上升。当超声波功率为100 W时，低聚肽收率达到最大，比空白组提高了31.7%；当功率为150 W时低聚肽含量则达到峰值的66.0%，比空白组提高了52.8%。随后，跟图1结果相似，超声波功率的进一步增加对低聚肽含量和收率会产生负面影响。

图1 超声波功率对木瓜蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by papain

图2 超声波功率对胃蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by pepsin

超声波功率对胰蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响如图3。从图3可以看出，当功率为100 W时，低聚肽收率达最高值（相比无超声组提高了27.7%），但与150 W时相差不大；而当超声波功率为100、150或200 W时，低聚肽含量较高，达到60.5%以上，比无超声组提高了71.4%以上。

超声波对中性蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响与上述三种情况略有不同（图4），表现为低聚肽收率最高值出现在较高功率（200 W），而低聚肽含量峰值则出现在较低功率处（100 W）。与无超声组相比，低聚肽收率和含量分别提高了19.5%和42.7%。

图3 超声波功率对胰蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by trypsin

图4 超声波功率对中性蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

目前，利用超声波辅助酶解各类蛋白制备多肽的研究已有文献报道。李杨等[9]采用超声辅助酶解红豆，结果多肽得率有显著提高；夏陈等[10]采用超声波辅助木瓜蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白，水解度由16.6%提高到25.6%。在本试验中，超声波辅助对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解东海乌参胶原蛋白均有促进作用，可显著提高低聚肽含量和收率。无超声波辅助时，胰蛋白酶酶解后的低聚肽收率和含量最低，中性蛋白酶最高。然而，超声波辅助后，胰蛋白酶的低聚肽收率和含量分别提高了27.7%和74.5%，中性蛋白酶则只提高了19.5%和42.7%。低聚肽收率和含量提高幅度最大的是木瓜蛋白酶，分别达到32.2%和82.3%。造成这种差异可能是因为超声波辅助后，东海海参胶原蛋白部分隐藏在内部的氨基酸残基暴露，而上述蛋白酶的水解位点各有不同，从而水解程度不同。当超声波功率达到300 W时，4种蛋白酶酶解后低聚肽收率和含量均有不同程度的下降，造成这种结果的原因可能是超声波功率太大，对蛋白酶结构造成破坏，导致酶变性失活。考虑到中性蛋白酶水解后低聚肽含量最高，达70.5%，故后续采用中性蛋白酶进行酶解。

2.2 温度对东海海参胶原蛋白酶解的影响

由于本试验是在超声波处理的同时进行酶解反应，所以酶解的温度也即为超声波处理的温度。考察了温度对中性蛋白酶水解东海海参胶原蛋白的影响，如图5。随着酶解温度的上升，低聚肽含量和收率均不断提高，直到60℃达到最高值。这与文献报道的中性蛋白酶酶解的最适温度（50～55℃）有所差异，可能是较高温度下，超声波的效果占主导因素。若继续提高温度，中性蛋白酶失活将占主导，导致酶解效果变差，故选择60℃为酶解温度。

2.3 pH对东海海参胶原蛋白酶解的影响

pH是影响酶催化反应的重要因素，故本试验对反应pH进行优化。结果如图6所示，低聚肽含量和收率开始随着pH的增大而明显升高，在pH 7.0达到最大；随着pH继续增大，低聚肽含量和收率开始降低。这是由于过酸和过碱都会对中性蛋白酶的结构造成破坏，引起酶活性的下降，故选择7.0为中性蛋白酶酶解pH值。

图5 反应温度对中性蛋白酶酶解胶原蛋白的影响Fig.5 Effect of temperature on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

2.4 酶量对东海海参胶原蛋白酶解的影响

从图7可以看出，随着中性蛋白酶添加量的增加，低聚肽含量和得率逐渐升高；当酶添加量为5%时，低聚肽含量和收率达到峰值；继续加大酶量，低聚肽含量和收率基本趋于稳定。

2.5 反应时间对东海海参胶原蛋白酶解的影响

在中性蛋白酶添加量5%，温度60℃，pH 7.0条件下，考察了水解时间对低聚肽含量和收率的影响，结果如图8所示。随着反应时间的延长，低聚肽含量和收率不断上升，当反应时间为20 min时，低聚肽含量和收率达到最高值，分别为75.4%和52.9%。随着反应时间进一步延长，低聚肽含量和收率略有下降，这可能是因为有少部分低聚肽被进一步水解成氨基酸。

海参体壁含有丰富的胶原蛋白，很多学者通过酶解制备小分子肽，从而改善其难于被体内吸收的特性。王天明等[5]利用胰酶和木瓜蛋白酶双酶解海地瓜，酶解液中小分子肽（＜3 kDa）含量达到43.9%；苏永昌等[7]利用中性蛋白酶对地瓜参进行酶解，在最佳酶解工艺条件下，多肽得率仅为6.9%。本文采用超声波辅助酶解，在最佳酶解条件下，酶解液中低聚肽（＜1 kDa）含量达到75.4%，收率最大达52.9%，大大提高了酶解效率。

2.6 东海海参胶原蛋白低聚肽的体外抗氧化性能

研究发现，海参蛋白肽具有显著的抗氧化功能。陈卉卉等[6]的研究发现，用木瓜蛋白酶水解东海海参胶原蛋白得到的多肽具有较强的清除自由基的能力，其中分子质量小于5 kDa的多肽抗氧化能力最强，羟基自由基和超氧自由基的清除率分别达93.1%和88.5%。肖枫等[11]利用菠萝蛋白酶水解海棒槌胶原蛋白，所得产物对超氧阴离子自由基的清除率可达到52.20%。赵玲等[12]对4种海参多肽抗氧化活性进行了比较，发现4种海参多肽对DPPH清除率顺序是：刺参＞加州拟刺参＞东海海参＞大西洋海参；袁坤山等[13]利用碱性蛋白酶酶解白肛海地瓜蛋白制备抗氧化肽，得到的多肽对DPPH的清除率达到20.6%。本试验测定了不同浓度下东海海参低聚肽的DPPH和ABTS清除率，结果如图9所示：随着东海海参胶原蛋白低聚肽浓度的增加，DPPH和ABTS清除率均逐渐增大，其中ABTS的清除率较DPPH更高。当低聚肽浓度大于2 mg/mL时，ABTS的清除率均在80%以上；当低聚肽浓度为8 mg/mL时，DPPH和 ABTS的清除率分别为 21.1%和87.2%。

选择低聚肽浓度为8 mg/mL，进一步考察了DPPH和ABTS清除率随着处理时间的变化情况。从图10可以看出，ABTS的清除率在5 min时即达到80.7%，随后随着处理时间的延长，清除率趋于平缓。DPPH的清除率随着时间的延长则逐步增加，由5 min时的3.0%提高到30 min时的19.0%。该实验结果说明，东海海参胶原蛋白低聚肽对ABTS的清除效率显著高于DPPH，这与其他学者的研究结果一致[14]。

图6 pH对中性蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.6 Effect of pH on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

图7 中性蛋白酶的添加量对酶解海参胶原蛋白的影响Fig.7 Effect of adding amount of neutral protease on hydrolysis of A.molpadioides collagen

图8 反应时间对中性蛋白酶酶解海参胶原蛋白的影响Fig.8 Effect of reaction time on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

图9 低聚肽浓度对DPPH和ABTS清除的影响Fig.9 Effect of oligopeptide concentrations on removal of DPPH and ABTS

3 结论

本文以东海海参胶原蛋白为原料，以低聚肽（分子量＜1 kDa）含量和收率为指标，首次采用超声波辅助酶法制备东海海参胶原蛋白肽。在碱性蛋白酶酶解后，分别采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶进行二次酶解，考察了超声波功率对酶解后低聚肽的含量和收率的影响。结果说明，超声波辅助处理对4种蛋白酶酶解东海海参胶原蛋白均有显著促进作用。综合考虑低聚肽含量和收率，选择中性蛋白酶为最适酶，最佳超声波功率为100 W。然后对超声波辅助下中性蛋白酶酶解工艺进行优化，得出最优酶解条件为：酶解温度60℃，酶解pH 7.0，酶添加量5%（w/w），酶解时间20 min。在最佳工艺条件下，低聚肽含量和收率最大达75.4%和52.9%。该低聚肽清除DPPH和ABTS的效果均随低聚肽浓度的增加而增强。当低聚肽浓度为8 mg/mL时，DPPH和ABTS的清除率分别为21.1%和87.2%。DPPH和ABTS的清除率与时间曲线表明，东海海参胶原蛋白低聚肽对ABTS的清除非常迅速，而对DPPH的清除则随处理时间的延长逐渐增强。后续将对该低聚肽进行分离，以获得活性较高的单一肽，并进行氨基酸序列测定。

图10 处理时间对DPPH和ABTS清除率的影响Fig.10 Effect of treatment time on DPPH and ABTS clearance rates