猪源β-防御素2 和3 的研究进展

刘璨颖，陈志胜，林裕锋，计慧琴，王丙云，陈胜锋

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528000）

防御素是一类自然产生的防御分子，具有广泛的抗细菌、病毒、真菌活性，且病原微生物不易对其产生抗性。防御素的免疫调控功能日益受到重视，其在炎症、创伤疾病治疗和促进机体生长方面也有一定作用[1-6]。防御素依据其二硫键的位置分为3 个亚类（α-、β-和θ-防御素）[7]。目前，未见α-和θ-防御素在猪中被报道，而在猪中被鉴定的β-防御素有29 种[8-10]。大多数β-防御素基因有典型的2 个外显子结构，其中第1 个外显子编码疏水性富含亮氨酸信号序列的前肽，第2 个外显子编码有活性的成熟多肽。成熟多肽含有6 个稳定的半胱氨酸，分别以1-6、2-4、3-5 连接形成3 个分子的二硫键，构成稳定的反相平行的3 股β- 片层结构[6]。大多数猪源β-防御素（Porcine β-defensin，pBD）和人源β-防御素（Human β-defensin，hBD）在序列长度和保守性上有很大相似性。系统发育分析发现，人源和猪源的防御素基因来源于同一个祖先，不同物种中对应防御素的同源性高于同物种不同防御素的同源性[10]。

在目前的养猪业中，由抗生素滥用导致的病原微生物耐药性给畜牧养殖和临床治疗造成了严重威胁[11]，急需可以代替抗生素的新型抗病原微生物药物。β- 防御素作为动物机体天然分泌的小分子活性多肽，具有较好的抗病原微生物活性和免疫调节功能。β- 防御素有独特的抗菌作用机理，使得病原菌不易对其产生耐药性[9]。因此，pBD 在畜牧养殖和临床治疗中具有替代抗生素的潜能。猪源β- 防御素2（Porcine β-defensin 2，pBD2）和猪源β- 防御素3（Porcine β-defensin 3，pBD3）分别是含有69 和67 个氨基酸的多肽。成熟多肽pBD2 在氨基酸序列上与人源β- 防御素1（Human β-defensin 1，hBD1）有60%的同源性。之前已有关于猪源防御素研究进展的综述，主要集中于pBD 的分子结构、体内分布、抗菌机制和表达方法的研究[9,12-14]。本文综述了近些年pBD2 和pBD3 表达调控的相关因素、参与调节的信号通路、在生殖发育中的新功能和在畜牧养殖中的应用，阐述其发挥生物活性的机制和潜在的应用价值，并对今后pBD2 和pBD3 的研究方向进行展望。

1 pBD 的表达和调控

1.1 pBD 在体内的表达特性 猪源β- 防御素在体内的表达具有种类差异性，也有组织特异性和品种差异性。例如，pBD2 和pBD3 均在骨髓及其他淋巴组织中表达，包括胸腺、脾、淋巴结、卵巢、十二指肠和肝脏；除此之外，pBD2 也在舌、肾脏和大肠中表达，而pBD123、pBD125 和pBD129 主要在雄性生殖组织中表达[8,15]。pBD3 表达量最高的组织是舌和口腔黏膜，而pBD2 表达量最高的组织是肾脏和肝脏。pBD3 基因在藏猪大部分组织中的mRNA 表达量高于杜×长×大杂交猪，而pBD2 基因在杜×长×大杂交猪大部分组织中的mRNA 表达量高于藏猪[16]。在抗病力较强的地方猪种梅山猪的小肠黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等与外界接触的多个组织中，pBD2 和pBD3 的表达水平均高于杜×长×大杂交猪[17-18]。

1.2 pBD 的表达调控 pBD 的表达还受发育阶段调控，且不同种类防御素的表达调控模式不同。虽然pBD2 和pBD3 都在猪卵泡颗粒细胞中表达，但pBD2 的mRNA表达水平与卵泡发育阶段有关，其在小卵泡颗粒细胞中表达量最高，随着卵泡发育，其在大卵泡颗粒细胞中的表达水平逐渐降低；而pBD3 在大卵泡和小卵泡颗粒细胞中的mRNA 表达水平没有显著差异[18]。在仔猪空肠中，pBD2 基因的mRNA 表达水平在断奶后（出生35 d）较出生21 d 显著升高，可能是因为断奶破坏了肠道完整性，微生物入侵刺激了肠上皮分泌防御素[20]。pBD115 在2周龄猪的睾丸中表达水平较高，而在5 月龄猪的睾丸中不表达[8]。

pBD2 与pBD3 在体内外的表达水平受外源病原微生物、营养应激、炎性诱导介质、膳食化合物中短链脂肪酸及其类似物、维生素、Zn2+和L-异亮氨酸等调节[18-19,21-23]。在1×108CFU/mL 罗伊氏乳杆菌I5007 作用6 h 下，猪小肠上皮细胞系IPEC-J2 中pBD2 和pBD3 表达量增高，口服1×1010CFU 罗伊氏乳杆菌I5007 能提高新生仔猪空肠中pBD2 和结肠中pBD2 与pBD3 的表达量[24]。膳食化合物中短链脂肪酸（如组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠）能提高猪肾脏细胞PK-15 中pBD3 的mRNA 表达水平，但另一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古柳菌素不能调节pBD3 的表达水平，这可能与组蛋白去乙酰化酶抑制剂有不同的作用靶点有关[25]。在IPEC-J2 中也证实含有3～8个碳原子的短链脂肪酸对pBD2 和pBD3 基因的mRNA表达有较为显著的诱导作用，其中8～16 mmol/L 丁酸盐的诱导效果较好，丁酸盐的类似物甘油三丁酸酯、丁酸苄酯和4-苯基丁酸钠盐也有相似的诱导作用[21]。此外，在IPEC-J2 细 胞系 中，25 μmol/mL 或100 μmol/mL 硫酸锌和50 μg/mL 异亮氨酸也能提高pBD2 和pBD3 的mRNA 和蛋白表达水平[22]。营养元素中维生素A、D、E 均能够不同程度地诱导IPEC-J2 细胞pBD2 或pBD3基因的表达并促进其蛋白的分泌，其中，0.5～20 µmol/L 维生素A 的诱导效果最好。以杜×长×大杂交猪和荣昌猪为动物模型的体内实验结果显示，饲喂含2～200 IU/kg维生素A 日粮的实验组中，舌、口腔黏膜、小肠黏膜和肺等组织中内源性pBD2 和pBD3 的表达水平均有显著提高[17]。异亮氨酸、精氨酸和Zn2+处理IPEC-J2 细胞会使其pBD2 和pBD3 基因表达上调，而饥饿营养基处理会下调pBD 表达[16,22]。

1.3 pBD2 和pBD3 参与调节的信号通路 pBD2 和pBD3 参与调节的信号通路包括有丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）、沉默信息调节因子2相关酶1（Sirtuin1，Sirt1）、叉头转录因子（Forkhead box O，FoxO）、核 因 子-κB（Nuclear Factor κB，NF-κB）和Toll-样受体2（Toll-like Receptor-2，TLR2）信号通路等。TLR2 的激活能直接调节pBD3 的表达，外源肽聚糖能激活TLR2，TLR2 沉默的PK-15 细胞在受到肽聚糖刺激后pBD3 表达减少[25]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对pBD3 的诱导表达与NF-κB 信号通路的激活有关[25]。营养应激和氨基酸对IPEC-J2 细胞中pBD2 和pBD3 表达的调控与Sirt1、FoxO 和细胞外信号调节激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）信号通路可能有关，应激和营养物质可通过FoxO 依赖通路调节Sirt1，而Sirt1 可直接影响防御素的表达[23,26-27]；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸对pBD 的诱导表达可能与ERK1/2 的磷酸化有关[28]。pBD3 对猪源大卵泡颗粒细胞增殖和迁移的促进作用可能与激活MAPK- ERK1/2信号通路有关[29]。

2 猪源pBD2 和pBD3 的功能机制研究

2.1 pBD2 和pBD3 在抗菌方面的作用 防御素通过多种机制发挥抗病原微生物活性，其中包括阻止细胞壁生物合成、抑制生物膜形成、对外周的细胞壁穿孔，通过自身的正电荷残基与细菌细胞膜表面脂多糖或磷脂分子的阴离子电荷互作从而中和外毒素，或者增加细菌细胞壁的通透性，进入细菌直接靶向DNA 或RNA 而杀死细菌[30-32]。在猪源防御素中，pBD2 是研究较多的防御素；pBD2 对包括多耐药性菌株在内的革兰氏阴性和阳性菌都有较好的抑菌效果；4～8 µmol/L pBD2 能在3 h 内杀死鼠伤寒沙门氏杆菌、李斯特氏菌和红斑丹毒丝菌[33]，且超表达pBD2 的转基因猪对常见的呼吸系统病原菌胸膜肺炎放线杆菌的抵抗力增强[34]。此外，猪防御素和抗生素还有协同抑菌效果[35]。为了研究防御素正电荷残基与其抗菌能力的关系，有研究者对成熟pBD2 多肽（含有37 个氨基酸）中的8 个氨基酸位点分别进行单位点突变；在不影响pBD2 二级结构的前提下，用中性或碱性氨基酸代替酸性氨基酸来增加多肽的净正电荷，检测pBD2 突变体的抗菌活性[36]。该研究结果显示，具有最高正电荷的pBD2 突变体并没有显示出最强的抗菌活性，pBD2 突变体中仅有I4R 的抗菌活性较高；证实pBD2 的抗菌活性不仅与其正电荷残基有关，可能还与其正电荷残基在分子表面的排列、与其正电荷残基对分子和结构稳定性的作用等有关[36]。pBD2 突变体I4R不仅有更强的抗菌活性，而且其抗菌活性更持久，对猪红细胞的毒性低、溶血作用小，因此I4R 可能具有较好的临床应用价值[36]。

2.2 pBD2 和pBD3 在促进生长和抑制炎症方面的作用有研究证实pBD2 能促进仔猪生长，具有替代抗生素的潜力[37-39]。每千克基础日粮中添加5 g pBD2 可提高断奶仔猪的体重、平均日增重量和平均日采食量，降低仔猪断奶后腹泻发生率，能和益生菌一样影响肠道形态学指标，提高盲肠食糜中益生菌的拷贝数，减少病原菌[37-38]。饲喂防御素能够明显改善母猪体况，提高仔猪成活率和健康水平，从而提高养猪效益。妊娠母猪日粮中添加2 g/kg 基因工程防御素可提高仔猪出生成活率，降低弱仔率、死胎率、发病率和死亡率[39]。保育猪饲喂防御素后发病率和死亡率也得到降低[39]。此外，pBD2 能降低硫酸葡聚糖钠盐诱导的小鼠结肠炎症与黏膜病变；pBD2 可能通过上调与紧密连接和黏蛋白相关蛋白基因（包括闭锁小带蛋白1、2，紧密连接蛋白1，黏液素1 和2）的表达，抑制硫酸葡聚糖钠盐诱导的炎症，通过抑制诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶和细胞凋亡来发挥作用。pBD2 直肠内给药可能作为溃疡性结肠炎的一种新型预防措施[40]。

2.3 pBD2 和pBD3 在生殖方面的作用 近期有研究显示，部分pBD 与雄性动物精子的运动能力以及雌性动物卵泡发育有关[29,41]。5 μmol/L pBD1 和pBD2 能降低精子的运动能力，3 μmol/L pBD1 和pBD2 虽对精子活力无影响，但有较好的抑菌作用，因此3 μmol/L 的pBD1 和pBD2 可以用作猪精液贮液中的抗生素替代物[41]。pBD3能显著提高小卵泡颗粒细胞的增殖与迁移能力，且其增殖促进作用可能与pBD3 显著提高小卵泡颗粒细胞中增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）编码基因的mRNA 水平有关，而pBD2 对卵泡颗粒细胞的增殖无显著作用，50 μg/mL pBD2 还会抑制大卵泡颗粒细胞的迁移作用[29]。

2.4 hBD3 在临床应用中的研究 pBD 与hBD 在氨基酸序列上有一定的同源性。在临床应用研究中证实，hBD3 可以通过抑制巨噬细胞中的免疫反应而控制牙周炎的发展[42]，可以减轻由鼠伤寒沙门氏菌调节因子表达和增强粪肠球菌活性而引起的肠损伤[43]。hBD3 作为佐剂，还能显著提高金黄色葡萄球菌灭活疫苗的免疫效果[44]。hBD3 可以在转基因牛腺体中表达，并对致乳腺炎的病原菌有抑制作用[45]。对hBD3 功能片段的研究中发现，其氨基酸序列C 末端15 个氨基酸构成的小肽仍具有与hBD3 相当的有效抗菌活性、皮肤和细胞渗透活性，且该片段能够抑制脂多糖诱导的诱导型一氧化氮、一氧化氮合酶和细胞因子的产生，能作为治疗免疫疾病时的药物载体[46]。hBD3 的γ 核心片段（EEQIGKSSTRGRKCCRRKK）具有hBD3 最重要的生物学特性，对人类免疫缺陷病毒和单纯疱疹病毒有抗病毒活性[46]。此外，hBD3 的衍生物CHRG01 仅含有14 个氨基酸（KSSTRGRKSSRRKK）的多肽，也能渗透细菌的外膜而具有杀菌作用[48]。

3 小结与展望

pBD 除了具有较好的抗病原微生物活性和免疫调节功能外，对动物肠道内固有益生菌和细胞危害小，对动物机体生长和生殖发育也有一定的促进作用。因此，pBD 在畜牧养殖和临床治疗中具有替代抗生素的潜能，在畜牧养殖中可作为饲料添加剂使用。且在体外表达pBD 方面，有研究证实pBD2 在工程菌毕赤酵母中能大量高效表达，且能耐受高温、极端pH 和部分有机溶剂[49]，这为体外大量表达pBD 应用于畜牧养殖和临床治疗中提供了理论基础。但目前关于pBD 的研究远远落后于hBD，因此今后还需要不断挖掘pBD2 和pBD3 在畜牧养殖和疾病治疗中的应用价值，对其功能片段进行探究，该活性多肽将有望应用于临床，为多种疾病的治疗提供新手段。