奶山羊遗传育种与繁育技术研究进展

2019-01-13文/文静

中国乳业 2019年8期

文/文静

（庆阳伟赫乳制品有限公司）

奶山羊适应性强，分布广，日采食量低，具有单位体重产奶多、饲料范围广、抗病能力强等特性，非常适合中国人口众多、粮食不足的基本国情[1]。我国是世界上饲养奶山羊数最多的国家之一，具有快速发展奶山羊的数量优势。根据联合国粮食及农业组织（FAO）统计数据显示，截至2012年，世界范围内羊（包括山羊和绵羊）的存栏量为37 218.6 万只，其中我国存栏7 146.0 万只，占世界存栏量的19.2%，2013年我国奶山羊存栏为1 300 多万只[1，2]。

现代研究证明，羊奶中含有200 多种营养素和生物活性物质，其中球蛋白含量高于牛奶，而酪蛋白含量远低于牛奶，接近于人奶，更易于人的消化吸收。羊奶中的脂肪球大小仅为牛奶的1/3，同时羊奶中表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）能有效缓解皮肤衰老，所以羊奶被称为“奶中之王”[3]。在羊奶生产中，决定家畜转化率的主要因素是良种，如果没有产奶量高、乳品质好的奶山羊品种，就达不到优质高产的目标，不符合现代畜牧业的需求。因此，如何在做好引进优良品种的同时，充分利用杂交优势与遗传育种新技术，加快培育奶山羊新品种，是奶山羊产业发展中的关键环节。

1 奶山羊遗传育种进展

随着分子生物技术，如基因编辑技术的改进，基因组学、转录组学等新兴学科飞速发展。家畜动物育种计划和家畜动物分子遗传学研究取得大量突破性成果，家畜动物育种已经从传统的育种方法向快速改善动物基因型的分子水平方向发展，分子育种技术已渐渐成为奶山羊育种的新方向。

1．1 奶山羊的传统育种方法

传统育种方法是以遗传学的基本理论为基础、以表型选择为主的育种措施。根据表型值推断基因型或计算育种值，进而做出性能的总体评估。传统的奶山羊育种方法是将数量遗传学原理应用于育种实践，通过采用杂交改良、品系选育等技术，实现奶山羊品种不断改良和杂种优势利用的方法。数量遗传学是指运用数理统计方法和适宜的遗传模型分析数量性状遗传规律的理论科学，是遗传学的重要分支。

最佳线性无偏预测法（Best linear unbiased prediction，BLUP）是1949年Henderson 提出的。BLUP法主要广泛应用于种公畜的评定，而且用于估计遗传趋势和配合力等。BLUP法的基本原理是线性统计模型方法论与数量遗传学相结合，其模型包括固定效应和除残差效应外的随机效应。雒鸣峰和刘荫武教授应用BLUP法估计西农萨能奶山羊的育种值和遗传趋势，分析了过去的育种效果，为确定西农萨能奶山羊的育种目标，建立系统的选种体系，提供了基本参数和依据。研究结果显示，西农萨能奶山羊在1960—1985年间初产母羊300 天产奶量的遗传趋势为7.2 kg，表明西农萨能羊群的选育卓有成效[4]。

约束最大似然（Restricted maximum likelihood method，REML）法将校正固定效应后与随机效应有关的多元正态似然函数极大化，对观测值y的线性函数求导，约束K，x=0，求满足似然函数最大化的方差组分。REML法求得的方差组分估值不受先验值的影响，通过迭代可得到唯一解，其估计值不会越出参数空间。当样本含量较大时，REML法可得到近似无偏估值，对于均衡资料REML法可得到无偏估值。雒鸣峰和常智杰教授应用REML估测几项奶山羊产奶性状的遗传力、遗传相关和表型相关系数，得出西农莎能奶山羊第一胎母羊的最高日产奶量、90天产奶量和300天产奶量的遗传力分别为0.1397、0.2403和0.3746，三性状间存在很高的正向遗传和表型相关。忽略公羊间相关性会导致遗传方差的偏低估计[5]。在生产实践中，对于一个有限的育种群体，公羊间必然存在一定程度的相关性，因此估计遗传参数时应用A-1模型。

1．2 奶山羊现代育种方法

随着分子生物学研究的不断深入以及新的生物技术的出现，奶山羊现代育种工作可以采用的新技术有很多，如原核期胚胎显微注射技术、体细胞核移植技术、逆转录病毒载体技术、胚胎干细胞技术、SNP筛选技术、基因定点整合技术等。这些现代育种技术大大地缩短了育种时间，同时使育种方向更加明确。

1．2．1 显微注射技术

显微注射技术（Microinjection）由美国人G o r d o n发明，后经Brinster等人改进，一直沿用至今[6]。其原理是通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵的原核内，在DNA的复制过程中使外源基因整合到动物基因中，再通过胚胎移植到受体子宫内继续发育，获得具有新基因的奶山羊。

1．2．2 体细胞核移植技术

体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer）也就是体细胞克隆技术，是将成年羊的体细胞移植到去核的卵母细胞中，然后发育成新个体。1996年多莉羊的出生宣告该技术的成功[7]，2000年西北农林科技大学张涌教授克隆出第一只山羊[8]。随着技术进步通过体细胞克隆技术，可以将优良性状的奶山羊进行扩繁。

1．2．3 逆转录病毒载体技术

逆转录病毒载体技术用携带外援基因的逆转录病毒感染胚胎，从而导入外源基因。其基本原理是利用逆转录的长末端重复（longterminalrepeat，LTR）区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下游进行重组，再使其包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或微注射入囊胚腔[9]。携带外源基因的逆转录病毒进入细胞后，RNA反转录成cDNA，依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷酸序列，DNA可以整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体中。雷蕾等（2013）研究显示，采用山羊胎儿成纤维细胞为供体细胞，通过逆转录病毒携带四个转录因子，对山羊体细胞进行诱导重编程，并且将诱导重编程细胞定向转分化为神经样细胞和卵母样细胞[10]。

1．2．4 胚胎干细胞

胚胎干细胞（Embryonic Sterm Cell，ES）的研究萌芽于畸胎瘤干细胞，或者成为胚胎癌细胞（Embryonic Carcinoma Cell）。Steven最早发现ES细胞，她把小鼠早期胚胎移植到129只精囊或肾的被膜下[11]，得到了该细胞。胚胎干细胞是从哺乳动物囊胚内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）和原始生殖细胞（Primordial Germ Cell，PGCS）经体外分化、抑制培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化的细胞，具有自我复制、更新和发育全能性并产生后代能力的早期胚胎细胞[12]。胚胎干细胞在特定条件下可分化为200 多种细胞类型，并可构建心、肝、肾等各种组织和器官，最后能发育成一个完整的个体，但目前没有应用在奶山羊上的研究。

1．2．5 单核苷酸多态性

单核苷酸多态性（S i n g l e Uucleotide Polymorphisms，SNPs）是个体间由完全相同序列界定的单个核苷酸的差异，单碱基转换、颠换、插入和缺失，与其他分子相比，SNPs分辨率最高也最为丰富，覆盖基因组范围大，遗传性能比较稳定[13]。SNPs作为DNA研究工具，用于遗传图谱构建、品种改良、关联分析等很多领域。陈志等进行了山羊生长激素释放激素受体（Growth Hormone-Releasing Hormone Receptor，GHRH-R）基因SNPs的快速筛查，对基因频率进行了估算[14]。吴贤峰等进行了信号转导与转录活化蛋白3（Signal Transducers and Activators of Transcription 3，STAT3）和STAT5A基因SNPs研究[15]。严妍对奶山羊促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-Inhibitory Hormone，GnIH）基因SNPs研究，并和产羔数进行了关联分析[16]。

1．2．6 基因定点整合技术

基因定点整合技术是一种能够精确靶向修饰生物基因组，实现对基因定点敲除和外源基因定点整合的技术。新出现的有锌指核酸酶（Zinc-Finger Uuclease，ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Uucleases，TALEN）和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋白（CRISPRs/Cas9）系统[17]。3 种新型的基因组编辑技术通过特异性结构识别靶位点，核酸酶发挥切割作用对靶位点进行点编辑。Malpotra等（2017）通过CRISPRs/Cas9敲除了山羊原代培养细胞的rig-i基因[18]。周文军等（2017）通过CRISPRs/Cas9系统敲出了β-乳球蛋白基因[19]。关于基因定点整合技术在现代育种研究中处于实验室阶段，期待未来对奶山羊育种发挥切实的推进作用。

2 奶山羊繁育技术进展

人工授精、胚胎移植、同期发情等技术的应用对20世纪奶山羊的改良产生了巨大的影响。随着生物技术的迅猛发展，奶山羊繁育中以胚胎工程、基因工程为主体的高新技术将成为奶山羊繁育的主要方向，胚胎移植、体外胚胎生产会越来越成熟，将被更多的奶山羊生产实践繁育工作所采纳。

人工授精是指采用非自然交配的方式将精子递送到母羊生殖道中使奶山羊怀孕的一种辅助生殖技术，一般包括采精、精液检验、精液稀释、输精等步骤。人工授精技术提高了优良种公羊的配种效能和种用价值，加速奶山羊品种改良，促进育种工作。在生产实践中，20 只母羊配备1只种公羊，而采用人工授精技术，200 只母羊配备1 只种公羊，减少了种公羊的饲喂成本，降低了饲养管理费用。同时可有效防止各种疾病的发生，尤其是生殖道传染性疾病。目前人工授精技术已经被许多奶山羊养殖场所推广应用。

胚胎移植技术自20世纪30年代进入畜牧科学领域以来，首先在绵羊上获得成功，到40年代末和50年代初相继在山羊、猪、牛、马上取得成功。我国胚胎移植技术的研究从1973年开始，1974年在绵羊上获得成功。1980年王建辰等在西北农学院进行了奶山羊胚胎移植试验，并取得了成功[20]。随着同期技术及胚胎移植技术的提升，西北农林科技大学罗军教授团队于2010年试验中选用8 只供体羊，28 只受体羊，共收集116 只胚胎，其中选用86 只质量较好的胚胎进行移植，共产出37 只羔羊[21]。目前在生产实践中，已经有一些养殖场引入了胚胎移植技术，为养殖场改良生产群，提高良种数量提供了好的方法。在实践过程中，受同期处理、胚胎移植手术水平、奶山羊子宫容受性、饲养管理等多方面因素影响，奶山羊胚胎移植成功率还不是很高，同时花费相对较高。因此胚胎移植技术从实验室走向生产实践，还有待进一步提升。

性别控制技术是通过人工干预控制奶山羊后代性别比例的方法。奶山羊养殖场需要更多的母羊用于产奶，所以提高母羔的比例对于养殖场快速扩繁有重要的积极意义。目前主要使用流式细胞仪对精子进行分离，前期试验表明，奶山羊X染色体和Y染色体差异大于奶牛，在4%左右，更有利于进行分离。虽然有企业已经生产出奶山羊性控冻精，但是目前主要采用子宫角输精，技术难度较大，在生产实践中推广存在一定难度。