发酵法生产氨基酸工艺研究

鲁佩玉，孙青华

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266000)

氨基酸在工业生产中应用十分广泛，例如动物饲料添加剂、人类食物调味品以及化妆品和医疗产品的原料。氨基酸是生物体中蛋白质的组成模块，对生物体的代谢途径和代谢方式起调节作用[1]，是生命体的重要组成部分，氨基酸缺乏会导致人类和动物患病[2]。

自1907年开始生产谷氨酸钠(MSG)以来，氨基酸的市场需求逐年增加。据统计，2008年氨基酸市场总额约54亿美元[3]，预计到2018年底将超过94亿美元。然而，生产氨基酸的工业技术仍不完善，需要进一步的优化。出于这个原因，许多公司和学术机构开始在该领域进行研究，目的是寻找更经济、更环保的氨基酸生产途径。

氨基酸可以通过不同的方法生产，例如从蛋白质水解产物中提取、化学合成、酶促和发酵途径。目前工业上生产的氨基酸大多是通过发酵途径来实现的，在需氧或厌氧条件下，利用一种或几种微生物将底物中存在的糖类转化为广谱氨基酸，该方法与其他方法相比，具有较大优势。首先，发酵法生产的氨基酸对映体纯度较高，减少了后续的纯化步骤；其次，发酵过程在相对温和的条件下进行，能够防止产品进一步降解[4]，且成本较酶促法显著降低，但是发酵过程中需要维持无菌环境，搅拌以及补料都会增加资金投入[5]。

选择最优的氨基酸生产方法，需要参考众多标准，综合分析，如可用技术和资本投资、产品市场规模和收入、原材料和运营成本以及每个特定过程的环境影响。然而，由于发酵法的经济优势和环保优势，现已成为工业化规模生产氨基酸最常用的方法。

本文讨论了发酵工艺参数、与工业氨基酸生产相关的技术问题以及可能的改进方案，为氨基酸工业的进一步发展提供了技术支撑。

1 氨基酸生产中的工艺设计

1.1 过程监控

在发酵过程中，需要持续监测关键参数和过程变量，如接种物质量、pH、进料速率、通气流量和过程温度[6]。Villadsen等证明发酵过程中通气流量(OTR)能够显著影响氨基酸产率[7]，增加OTR能够使L-苯丙氨酸产率提高45%，而OTR增加却不利于L-色氨酸的生产，可见发酵过程中控制OTR意义重大。准确监控和调整产率还必须仔细选择恰当的工艺温度，对谷氨酸棒状杆菌的研究显示，高温(高达41 ℃)可以提高某些氨基酸如L-谷氨酸的产量[8]。人们还研究了耐高温细菌，例如甲醇芽孢杆菌，其可在高达50 ℃的温度下产生L-赖氨酸和L-谷氨酸[9]，这些耐高温细菌不仅可以增加目标产物的产率，还能够减少发酵过程中冷却水用量，进一步节约成本，提高经济效益。此外，发酵种子液制备是发酵过程中的关键步骤，因为它可以显著影响菌株的生产力和氨基酸产量。因此，为了确保种子液中菌株的最佳状态，菌株的稳定性和生产力应在转移到主发酵罐之前进行彻底测试。

1.2 分批补料

氨基酸工业中最常用的反应器操作模式是分批补料操作。该过程初始仅需要少量培养基和接种物，开发出预定的进料曲线，获得更高的产率或产量之后，再将碳源按进料曲线加入到反应器中。在此过程中，细胞和产物都保留在反应器中，发酵所需的营养物，如硫酸铵或纯氨、生物素、其他维生素，由最初的接种物提供。该模式确保了反应器中充足的氧气容量，以满足微生物的氧气需求，从而减少由于氧气限制而形成的副产物，更好地控制营养物的浓度，从而提高氨基酸的产率和产量。Abou-taleb等分别采用分批投料与一次性投料的方式对芽孢杆菌进行发酵，并进行对比[10]，实验证明，分批补料工艺的总氨基酸浓度比一次性投料工艺高出近1倍。尽管一次性投料在过程控制和技术方面相对简单，但与分批补料操作相比，一次性投料产率和重现性均较低，而分批补料操作不仅增加了发酵的过程性能，而且提高了发酵初始含碳量，降低了底物或产物抑制的风险。

1.3 连续生产

连续生产的操作模式可以提供比分批补料模式高2.5倍的氨基酸产率和过程输出[11]。然而，连续生产也存在着一定的弊端，连续的流入和流出，增加了反应器受污染的风险，发酵环境的连续改变还可能会引起菌株退化。Koyoma等以连续发酵的方式利用乳酸短杆菌生产L-谷氨酸，并与间歇法进行对比，实验发现连续发酵法较间歇法的L-谷氨酸产量高出1倍[12]。

此外，为了改善连续生产的性能，可以将多个生物过程串联。微生物的生长阶段可以在生产过程以外的反应器中进行，因而可以对2个阶段分别进行优化，此外，高生长速率可以缩短发酵时间，一定程度上可以缩小反应器的规模，增加输出。

1.4 下游分离纯化

有效的下游纯化方法对于降低氨基酸生产成本至关重要。通常采用离心和过滤的方法从发酵液中初步分离氨基酸，再根据目标氨基酸的性质，例如溶解度、等电点和吸附性等，选择合适的色谱方法进一步分离纯化。然而，由于纯化阶段所需步骤众多，每一步都不可避免而造成目标产物的损失，这也势必造成高纯度氨基酸生产成本提高。

由于膜工艺的高选择性和低热输入优势，引起了人们越来越多的关注，最常见的用于分离目标氨基酸的膜分离方法是离子交换膜[13]。为了进一步提高过程性能、降低成本，人们还研究了新的膜过滤方法，其中纳滤是压力驱动的膜过滤方法中的一种创新技术[14]。这些膜可以很容易地与传统发酵罐结合，在同一运营单元中将生产和净化相结合，从而减少资本投资。

1.5 流程建模与分析

氨基酸发酵工业的另一个关键因素是工艺放大。在规模较大的反应器中不同的几何和物理条件，可能会影响发酵的重要参数，从而导致工艺稳定性、重现性、产率降低，还可能引入更多的副产物，为后续纯化增加困难，影响产品质量。尤其是在工业生产中，微生物发酵过程常常受原料混合效率的影响，较低的混合效率与微生物细胞较高的代谢活性相结合，导致生物反应器中形成局部浓度梯度[15]，对氨基酸生产造成不利影响，而反应器尺寸增加使这个问题更加复杂。传统的发酵罐设计通常是将底物从发酵罐顶部供给，而气体则从底部供给，底物和氧的浓度梯度沿着反应器高度遵循相反的变化趋势。在工业发酵罐中，由于发酵罐高度增加，促使底物与氧的浓度梯度更明显，产生更大的底物和氧耗尽区，并且发酵罐内培养液体积增大，更强的水压梯度会影响氧转移速率，并且使混匀时间延长，这使得发酵罐顶部的微生物同时暴露于高糖浓度和低氧浓度下，而在底部微生物则暴露于低糖浓度和高氧浓度下[16]。反应器中处于高糖浓度和低氧浓度环境下的微生物会生产大量乙酸盐、乙醇、乳酸盐、氢气、琥珀酸盐和甲酸盐，这些酸产物会导致培养基酸化，再与搅拌产生的过量热一起诱导形成一定的压力区域，使该环境下的微生物不能更好地发挥作用。为了研究这些参数对工业过程的影响，已经应用了诸如计算流体动力学(CFD)和设备小试的方法来进行优化。

1.5.1 缩小设备

缩小反应器进行设备小试，作为模仿大规模生物反应器条件的工具用来预测产量和产率的变化，受到人们越来越多的关注。双搅拌釜反应器或推流式反应器是最常见的反应器类型，实验室中常利用这些设备来提供搅拌条件，从而选择更稳定的菌株，增强从小规模到更大规模的可转移性[17]。为了获得大规模反应器的最佳性能预测模型，缩小规模必须根据工业过程的相应条件进行适当的调整[18]。

1.5.2 流程建模

根据发酵工艺操作参数，工艺化学计量和环境因素的模型[19]，流程建模可以协助整个发酵过程中各个流程的设计和优化，推算出工艺效率，产物滴度，选择性以及最佳产率条件。此外，还可以通过计算流体动力学方法得到流体混合的抽象数学模型，以Reynolds平均的三维Navier-Stokes方程为基础,采用Eulerian-Eulerian法模拟工业规模生物反应器中流体的湍流特性[20]，最终可以得到有关流体速度，温度以及整个反应器中浓度分布的详细信息。

将模型获得的结果与按比例缩小设备获得的数据相结合，可以在开发的早期阶段确定最佳过程配置，帮助优化现有流程，协助新工艺开发。这种流程建模的方法尽管在计算领域已经进行了多项研究，但还需要更好的模拟器来支持反应器进一步放大。

1.5.3 过程强化

过程强化(PI)是提高氨基酸发酵产率的另一个重要方法，可以使发酵过程更安全、更洁净、更节能[21]。过程强化可以通过2种方法来实现：一种是增强设备，例如新反应器，热交换器或传质单元；另一种是使用创新的分离方法或技术来强化过程本身[22]，例如将反应器配置(操作模式)更改为分批补料反应器，可以使赖氨酸产率提高到一次性投料的2倍，在一次投料或补料分批操作之后，将60%或90%的最终发酵液转移到下游，而另一部分保留在反应器中，再将反应器用新鲜培养基重新填充至起始工作体积，并定期开始下一次发酵。减少在系统中引入新接种物所需的时间和制备无菌生物反应器的停机时间，缩短发酵周期，提高氨基酸生率，工艺的经济性显著提高[23]。

膜分离技术是一种良好的创新分离方法，该方法能够改善发酵工艺性能，实现特定化合物的有效运输。电膜过滤技术已经应用于分离氨基酸，Kumar等已经利用L-谷氨酸和L-赖氨酸等电点不同以及所带电荷相反的性质，采用电膜分离技术成功将两种氨基酸分离，其中L-谷氨酸的回收率达到85%，这一实例证明了该技术在工业应用中具有巨大潜力。该方法可以将发酵过程与分离过程结合到同一单元操作中，从而实现过程强化。

2 结论

由于经济和环境的优势以及基因工程技术的发展，发酵成为工业化生产氨基酸最常用的技术。优化发酵工艺对于提高效率、减少成本至关重要，创新的分离技术，如纳滤膜，可以整合到发酵罐中，将生产和净化相结合。此外，能够模仿大规模反应器的技术，如流程建模或缩小设备，可以减少反应器工业放大引起的诸多问题。因此，将流程建模、过程模拟和代谢工程工具结合起来，可以在过程设计早期开发阶段得到最佳工艺参数，从而最大限度地减少工艺过程的不确定性。