米曲霉次生代谢产物真菌毒素研究进展

孙莉，胡文康，付彬，沈婉莹，徐宁

(湖北工业大学 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科、曲霉属，它的应用历史悠久，早在我国周朝就开始用其酿造豆酱，随后传入日本、朝鲜等亚洲国家，当今也是亚洲发酵食品生产中使用的主要酿造真菌[1]。真菌在生长过程中会分泌大量的次生代谢产物，而这些代谢产物往往是具有有效的生理活性的低分子量物质，通过分子生物学、生物信息学和比较基因组学的研究，表明真菌次生代谢产物是由成簇的基因编码的[2]。米曲霉基因组已被破译，比同属中重要的病原菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和工业发酵菌黑曲霉(Aspergillusnidulans)大25%～30%，因此米曲霉可能产生更丰富的次生代谢产物[3]。食品安全问题已经是一个全世界都关注的问题，其中真菌毒素引起的食品安全问题日益严重，这些毒素就来源于真菌代谢产生的次级产物。虽然米曲霉是目前世界上公认的安全食用菌种，但是随着对米曲霉次生代谢产物的深入研究，发现其中存在少量种类的真菌毒素，存在潜在的食品安全危害，可能对人体健康造成危害[4]。本文综述了米曲霉次生代谢产物真菌毒素的研究进展，有助于避免米曲霉真菌毒素可能引起的食品安全风险。

1 环匹阿尼酸

环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)是一种吲哚-六氢茚-吡咯烷类神经毒素(indole-hydrindane-tetramic acid neurotoxin)，分子式为C20H20N2O3，是曲霉属次生代谢产生的真菌毒素之一[5]。CPA是由Holzapfel C W首次在青霉菌中分离得到的，并在1977年证实CPA存在于米曲霉中[6]。Yokota T等第一次从米曲霉中分离出CPA，并用蚕来证实其可以引发病变[7]。而后研究发现传统食品酿造中使用的米曲霉并未代谢产生CPA，只在一些野生型米曲霉中有发现[8]。Hill J E等又利用小鼠实验进一步证实了CPA的毒性作用[9]。CPA的毒性机理已研究得较为清晰，其毒性与黄曲霉素相当，主要是抑制了Ca2+-ATP酶，从而阻断Ca2+的转移，使得心肌收缩力减弱[10]。

米曲霉在固态培养和液态培养中均可生成CPA，但CPA的毒性往往因为与它同时存在的黄曲霉毒素而被人们忽视[11]。薄层色谱法是目前在真菌培养以及农产品中应用最普遍的CPA测定方法[12]。赵删等[13]利用高效液相色谱法测定米曲霉中CPA的含量，所建立的方法快速、简便、准确。Rodríguez A等研究出了实时定量PCR(qPCR)方法，对参与CPA生物合成的酶：二甲基烯丙基色氨酸合成酶设计特异性引物(dmaTF/dmaTR)，利用TaqMan探针(dmaTp)对dmaT编码基因进行杂交，在不同的人工接种食物中评估qPCR方案量化CPA产生霉菌的能力，这种方法可以用来在HACCP监管体系中防止整个食物链中CPA产生的风险[14]。以上方法为米曲霉真菌毒素CPA安全检测提供了技术支持。

2 3-硝基丙酸

3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid, 3-NPA)是一种由多种霉菌产生的具有神经毒性的真菌毒素[15]，分子式为C9H9NO4。第一次在米曲霉中发现并分离出来是由Nakamura S团队完成的[16]，随后Matsumoto H等对3-NPA结构的光谱学特征进行了分析和报道[17]。3-NPA是一种琥珀酸脱氢酶(SDH)抑制剂，它会在纹状体中产生行为、生化和组织学变化，在动物和人类中引发亨廷顿病[18]。它产生的纹状损伤是一种中枢神经系统中毒的表现，有多种生理反应例如呕吐、眩晕、抽搐等，严重者还会导致死亡。还有相关报道指出3-NPA可能发生中毒，从而导致儿童延迟性肌张力障碍[19]。研究发现它会引起小鼠模仿年老老鼠的认知和运动的缺陷。Haine S， Kari M比较了生理盐水和3-NPA(剂量为420 mg/kg)对小鼠的影响，使用迷宫和小鼠转棒实验(rotarod test)测试了运动协调性，结果显示注射3-NPA比注射生理盐水出现错误多很多[20]。研究还发现每4天向6～10周大的小鼠腹腔内注射剂量为10 mg/kg的3-NPA，连续28天便可以引起小鼠神经变性[21]。George A等对3-NPA进行了安全性评价，认为成人3-NPA的安全摄入量应不超过25 μg/kg·天[22]。3-NPA在米曲霉的固态和液态培养中均可以产生，但其毒性比CAP要弱。3-NPA检测方法已经开发许多种，如Shao G J等开发利用固相萃取-离子色谱法测定甘蔗中的3-NPA；胡文娟等利用薄层色谱法检测了甘蔗中3-NPA的含量；刘勇等[23]用液相色谱法和气相色谱法检测了动物血浆中的3-NPA含量；江涛等用液相色谱检测方法测定了米曲霉菌培养物中3-NPA的含量[24]。

近年来，人们致力于抑制3-NPA毒性的研究，Jang M等研究发现1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷可能会预防和改善3-NPA 诱导小鼠模型中亨廷顿病的神经损伤和纹状细胞死亡[25]。Colle D等研究发现丁二醇可以通过负转录调控来预防3-NPA诱导的线粒体功能障碍和氧化应激(一种血管病变的重要病理过程)[26]。Calderón G D研究验证了脑活素在治疗3-NPA中毒的鼠脑中保护大脑免受自由基影响的假设[27]。 因此，人们对3-NPA的防治越来越完善。

3 麦芽米曲霉素

麦芽米曲霉素(maltoryzine) 是一种曲霉属真菌毒素，分子式为C11H12O4，最早是由Iizuka H等从米曲霉发酵液中发现并分离出来，并发现它对小鼠有肌麻痹作用，腹膜下给药IC50为3 mg/kg[28]。麦芽米曲霉素可能会对脑中枢神经具有损害，并有麻痹、饮食不进的风险，但目前尚未发现其具有致癌或基因致癌的作用。

Abdelghany T M等利用HPLC技术对黑曲霉中的麦芽米曲霉素进行纯化和测定，具体方法是将黑曲霉分别接种在含有2%小麦粒的天然培养基和合成培养基(Czapek Dox)于250 mL锥形瓶中，每个瓶中含有40 mL调节至pH 6.5的培养基，并在(28±2) ℃下培养10天。再将分离出的培养物单独混合，然后在真空下过滤除去生物质，用正丁醇萃取，并将有机溶剂在真空下蒸发至干燥，得到粗提取物。将5 g粗提取物溶于CH3OH(HPLC级)中。通过HPLC分离提取器，C18色谱柱(200 mm×4.6 mm×5 μm)进行检测，流速为1 mL/min，流动相为80%甲醇水溶液。通过UV检测器在波长215 nm处进行检测。通过具有不同浓度的二甲双胍A和C的标准曲线进行测定[29]。

此方法为米曲霉中的麦芽米曲霉素的检测提供了借鉴方法，方便人们更加深入地研究米曲霉在不同培养条件下的毒素产生情况。

4 曲酸

曲酸是(kojic acid)是米曲霉的主要次生代谢物之一，分子式为C6HO4，它广泛应用于食品、药品和化妆品中。曲酸首先被报道为一种来自于蒸米上的米曲霉的结晶物质[30]。 Burdock G A等发现用谷物固态发酵的方法可以使曲酸高产，同时他们还发现曲酸的结构与己糖有着类似的相对简单的代谢途径。目前尚未报道由口服剂量引起的急性或亚慢性毒性，但如果注射曲酸，则可能发生惊厥[31]。由于它可以对酪氨酸酶的活性有一定抑制作用[32]，学术界对曲酸的安全性颇有争议。在化妆品领域，曲酸因为有抗黑色素形成的作用而作为美白剂[33]。但Nakagawa M等对220位怀疑因使用化妆品而患有皮炎的女性患者进行了斑贴试验，其中8名使用含至少1种曲酸产品的患者中在开始使用含曲酸的产品后1～12个月出现面部皮炎[34]，从而进一步证明曲酸可能会对皮肤产生不良反应。Zhang X还发现曲酸在一定程度上减少了叶绿素的损失以及水的蒸发，可作为一种保鲜剂。Wang 等还发现曲酸可以保护小鼠免受伽马射线辐射的伤害，他们对30天生存率雄鼠的外周血参数进行变化评估测试，注射300 mg/kg体重的曲酸的实验组与空白对照组的老鼠在一次致命剂量的照射下，注射曲酸的组所需致命剂量更高[35]。

曲酸的测定方法有很多种，Piantavini M S等利用紫外分光光度法来测定曲酸含量， Jiang Q等用高效液相色谱(HPLC)方法，利用电化学检测器来测定食品或化妆品中曲酸的含量[36]，Lin Y H 等还利用毛细管电泳法对化妆品中的曲酸进行分析。此外，还有铜沉淀法、氯化铁比色测定法等。

曲酸在病例毒性上尚未明确，但根据其会对皮肤造成损害的特点将其暂时归为真菌毒素类，因其存在损害皮肤以及美白等影响，深入研究曲酸仍然具有重要意义。

5 结论与展望

米曲霉在我国以及整个亚洲地区的发酵食品中都有着非常广泛的应用，其次生代谢产物真菌毒素的安全性更是得到人们的密切关注，本文对4种主要米曲霉真菌毒素的起源、病理毒性、检测方法与防治进行了综述，为米曲霉在发酵食品工业和生物工程产酶载体等领域的安全应用提供了参考思路。现阶段对米曲霉产真菌毒素的条件和代谢机制尚未清晰，还需要深入的研究，指导食品用米曲霉的选育、发酵代谢调控和安全评估，以消除潜在真菌毒素的危害。