荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌复合群对利福平和异烟肼耐药性的价值

吴慧娜 孙付胜 刘清文 戎中录 张纪东 高阳 李永福 常斐

耐药结核病尤其是耐一线抗结核药物异烟肼(INH)和(或)利福平(RFP)的结核病对结核病控制工作提出了严峻挑战。因此，采用更加快速和准确的检测方法来检测结核分枝杆菌(MTB)的耐药性，特别是针对RFP和INH的耐药性检测，对于患者的有效治疗至关重要。比例法药物敏感性试验(DST)是目前检测一线抗结核药物对MTB耐药性的金标准，主要基于适合MTB生长的罗氏固体培养基(Löwenstein-Jenden，L-J)和BACTEC MGIT 960液体培养基(简称“MGIT液体培养基”)接种培养。由于MTB生长缓慢[1]，这些方法耗时较长(MGIT液体培养基耗时约为14 d，L-J罗氏固体培养基耗时约为28 d)，导致患者诊断和治疗的延误，错过最佳治疗时间。

荧光PCR探针熔解曲线法(简称“探针熔解曲线法”)耐药突变检测是利用多色探针熔解曲线分析技术针对MTB耐药基因是否发生突变所建立的方法。该方法的检测原理是通过监测针对特定耐药基因设计的荧光标记探针，在PCR扩增后的熔解分析中是否发生熔点变化来判断探针覆盖区域是否发生基因突变。由于可以采用多色荧光标记，可以在一个PCR反应中设计多条探针，达到多重检测的目的；具有简便快速、覆盖位点全面等特点。本研究对临床分离的结核分枝杆菌复合群(MTBC)菌株进行RFP和INH的耐药性检测，评价该方法用于实验室诊断耐药结核病的价值。

资料和方法

一、研究对象

2015年1月至2018年7月，由菏泽市各县(区)结核病防治所通过中国疾病预防控制信息系统上报883例肺结核和耐多药结核病(MDR-TB)患者，并将患者痰标本送至山东省菏泽市传染病医院。所有痰标本按照《结核病实验室检验规程》[2]的操作程序进行处理。收集其中萋-尼染色结果为阳性的结核病患者的痰标本共215份(例)进行分离培养，污染5株(例)，培养阴性8株(例)，获得阳性菌株202株(例)。202株(例)分离培养菌株经菌种鉴定有2株(例)为非结核分枝杆菌(NTM)，200株(例)为MTBC。

二、研究方法

1. 分离培养：对涂阳痰标本按照文献[2]的操作方法进行分离培养，培养基为改良罗氏酸性培养基，由珠海贝索生物技术有限公司提供。

2. 分枝杆菌鉴定及DST：培养阳性产物按照文献[2]的操作方法进行MTBC鉴定和比例法耐RFP和(或)INH的DST，MTBC鉴定使用对硝基苯甲酸(PNB)培养基(500 μg/ml)、RFP药敏培养基(50 μg/ml)和INH药敏培养基(1 μg/ml)，均由珠海贝索生物技术有限公司提供。

3. 探针熔解曲线法：经鉴定为MTBC的菌株采用探针熔解曲线法(结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒和结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒；均为厦门致善生物科技股份有限公司提供)检测RFP和INH的耐药性，实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

4. 质量控制：山东省菏泽市传染病医院检验科每年培养的污染率均低于5%，DST已通过国家结核病参比实验室组织的熟练度测试。探针熔解曲线法操作按照说明书的要求，严格进行质量控制。

5. 不一致的结果分析：对于探针熔解曲线法与DST检测结果不一致的标本进行测序，引物序列如下：rpoBF(5′-GCGTCGGTCGCTATAAGGT-3′)/R(5′-ACGGGTGCACGTCGCG-3′);katGF(5′-CACACTTTCGGTAAGACCCA-3′)/R(5′-GAA-ACTGTTGTCCCATTCG-3′);mabA-inhAF(5′-CGCTGCCCAGAAAGGGA-3′)/R(5′-TCCTCCGGTAACCAGGACTC-3′);oxyR-ahpCF(5′-ACTGCTGAACCACTGCTTTGC-3′)/R(5′-TGATCG-CCAATGGTTAGCAG-3′)。在ABI 3730自动DNA测序仪上对扩增的DNA产物进行测序，并与NCBI GenBank数据库中的序列进行比较。

三、统计学处理

以DST检测结果为标准，计算探针熔解曲线法的敏感度、特异度及其95%置信区间(CI)和符合率；并进行一致性分析(Kappa检验)。本研究统计数据采用MedCalc 11.4.2软件进行计算。Kappa值≥0.60认为两者有较高的一致性[3]。

结 果

一、菌种鉴定和DST

200株(例)MTBC分离株DST结果显示，110株(例)耐RFP(10株单耐RFP)，144株(例)耐INH(44株单耐INH)。

二、探针熔解曲线法检测

以DST检测结果为标准，探针熔解曲线法检测RFP耐药的敏感度、特异度和符合率分别为96.4%(95%CI：90.7%～98.9%)、80.0%(95%CI：70.5%～87.1%)和89.0%；一致性分析结果显示，Kappa=0.78(表1)。

以DST检测结果为标准，探针熔解曲线法检测INH耐药的敏感度、特异度和符合率分别为85.4%(95%CI：78.6%～90.7%)、96.4%(95%CI：87.7%～99.6%)和88.5%；一致性分析结果显示，Kappa=0.74(表2)。

三、不一致结果分析

在对RFP的耐药性检测中，200株(例)MTBC分离株中有22株(例)DST和探针熔解曲线法检测结果不一致：其中有18株(例)分离株DST检测结果为对RFP敏感，但是探针熔解曲线法检测到耐药基因突变，测序结果显示上述标本在检测的基因区域均发生了突变；另有4株(例)DST检测为对RFP耐药，经探针熔解曲线法检测为敏感，测序结果显示这4株(例)在检测的基因区域均未发生突变。表型DST和探针熔解曲线法之间的总体符合率为89%(178/200；95%CI：83.5%～92.7%)。

在INH耐药性检测中，200株(例)MTBC分离株中的23株DST和探针熔解曲线法检测结果不一致。其中2株(例)分离株为DST敏感，但是通过探针熔解曲线法检测到突变，后续的基因测序证实了这2株(例)分离株分别在katG315密码子和ahpC启动子区域发生了突变，而另外21株(例)被DST检测为INH耐药的分离株，探针熔解曲线法未检测到耐药突变，后续的基因测序也证实了在试剂盒上述检测区域未发生基因突变(表4)。

讨 论

一、分子药敏试验检测方法简介

近年来，分子药敏试验检测方法由于具有简便、快速及检测结果准确等优点，越来越受到临床的认可。目前有几种基于核酸扩增的商业诊断试剂盒。其中GeneXpert®MTB/RIF(美国Cepheid公司)是一种实时半定量PCR检测方法，直接使用痰样本来检测MTB和RFP耐药性基因突变；INNO-LiPA Rif.TB(比利时Fujirebio公司)和GenoType MTBDRplus(德国Hain Lifescience公司)基于反向印迹杂交探针的线性探针测定，用于快速诊断MDR-TB[5-8]。本研究采用探针熔解曲线法检测了MTBC对RFP和INH的耐药性，依据本研究结论及临床操作总结，笔者认为其具有以下特点：(1)检测快速、通量高，对临床分离株培养物样品检测可在3 h内完成；(2)操作简便，PCR与荧光探针杂交可在同一反应体系内实时进行，不需要PCR扩增后的杂交过程；(3)PCR与荧光探针杂交在同一反应体系内闭管进行，不易造成实验室样品间PCR扩增子的交叉污染；(4)检测结果阴性、阳性可通过熔解曲线熔点进行判定，结果分析客观，易判定。

表1 以DST为标准评价探针熔解曲线法检测MTBC(200株)对RFP耐药性的效能

注DST：药物敏感性试验；敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；符合率(%)=(真阳性例数+真阴性例数)/(真阳性例数+假阳性例数+真阴性例数+假阴性例数)×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0为实际一致性，pe为理论一致性； 95%CI值的计算方法见参考文献[4]

表2 以DST为标准评价探针熔解曲线法检测MTBC(200株)对INH耐药性的效能

注DST：药物敏感性试验；敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；符合率(%)=(真阳性例数+真阴性例数)/(真阳性例数+假阳性例数+真阴性例数+假阴性例数)×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0为实际一致性，pe为理论一致性； 95%CI值的计算方法见参考文献[4]

表3 基因测序与两种技术检测RFP耐药性结果不一致菌株的比较

注S：敏感；R：耐药

表4 基因测序与两种技术检测INH耐药性结果不一致菌株的比较

注S：敏感；R：耐药

二、探针熔解曲线法检测RFP耐药突变基因的评价

MTB 对RFP的耐药性是由RNA聚合酶的β-亚基突变引起的，RNA聚合酶是rpoB基因编码的RFP靶标[1]。现有的研究表明，rpoB基因中一段 长81个碱基的核心区域[编码507～533位，共27个氨基酸的密码子；又称为RFP耐药决定区(RRDR)]，当RRDR发生突变时，使RNA聚合酶β亚单位的结构改变，RFP不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合，而出现耐药[9]。超过95%的RFP抗性分离株在rpoB基因的81 bp热点区域内具有突变[3]，密码子516、526和531[9]是最常见的突变。本研究采用探针熔解曲线法的RFP耐药突变检测试剂，采用4条探针覆盖了rpoB基因507～533位核苷酸密码子，能检测该区域所有位点的突变。在研究中，大部分RFP抗性分离株在RRDR区域中具有突变。关于RFP抗性检测，探针熔解曲线法显示出与先前研究相似的敏感度和特异度；对于AnyplexTMⅡ MTB/MDR/XDR测定法(韩国Seegene 公司)敏感度和特异度分别为97%和100%[10]；GenoType MTBDRplus测定法敏感度和特异度分别为93.5%～98%和99%[11-13]；国内报道GeneXpert®MTB/RIF分子诊断系统检测以痰涂片、痰培养为标准的敏感度和特异度分别为93.27%、91.93%和91.60%、95.55%[14]，与DST相比，探针熔解曲线法对RFP耐药性检测的特异度仅为80.0%，低于此前的文献报道[15]。分析可能的影响因素为：首先，推测样本选择偏差可能是主要原因。本研究大部分样本来自已经确诊为结核病的患者，甚至一部分已经确认为MDR-TB患者，相对较少的真阴性标本可能会导致特异度的波动；其次，由于本研究采用的是罗氏固体培养基，敏感度和特异度均低于相同条件下的MGIT液体培养方法，可能是由于液体培养的前处理液采用的是较低浓度NaOH溶液处理痰标本，以及离心集菌的前处理方法，因而增加了对菌量较少标本的阳性检出率。故推荐有条件的实验室行分枝杆菌分离培养时尽可能采用液体培养的方法[16]，以提高阳性率。DST和探针熔解曲线法系统对RFP检测结果不一致的18株(例)分离株经序列分析证实确实存在突变，特别是部分位点，如rpoB531和526位点，是公认的耐药突变位点。因此，笔者推测DST结果可能存在问题，可能是由于技术错误或分析准确性造成的。另外，这18株(例)存在突变的不一致样本中出现了2株(例)rpoB511位点突变。该位点突变可能与RFP低度耐药相关，有研究表明对比例法或绝对浓度法敏感的某些菌株可能已出现RFP低度耐药，应用探针熔解曲线法检测rpoB基因511位点突变则可以发现此类菌株，给临床治疗以提示[17]。

三、探针熔解曲线法检测INH耐药突变基因的评价

katG315密码子，inhA启动子的-15和-8位点及ahpC启动子区域的-6～-47位点的突变可覆盖80%～90%的INH耐药性菌株。本研究中DST和探针熔解曲线法系统对INH检测结果不一致的23株(例)分离株经序列分析，有1例突变位点是katG315 AGC-ACC，1例在ahpC启动子区域-46位点发生突变。其余21例分离株经探针熔解曲线法系统检测未发生突变，经测序证实在试剂盒检测范围内也不存在突变。因此，推测是发生了检测范围外的突变，或者是其他机制所导致的耐药，尚需要进一步的研究来解决这些患者中未定义的基因和许多潜在的机制。

四、探针熔解曲线法优缺点及局限性

笔者推测，由于比例法对DST中接种量进行了校准，它采用了两种菌液浓度(10-2mg/ml和10-4mg/ml)，通过计算活性单位的比值进行判断，使结果更加精准。比例法DST将1%耐药百分比(耐药百分比=耐药培养基上生长的菌落数/空白培养基上生长的菌落数)定义为“敏感”和“耐药”的临界点[18]，而现在的分子检测方法，包括Sanger测序法，通常需要20%以上的耐药型比例才能检测出。尤其是对于异质性耐药的患者标本(体现细菌群体从部分耐药向完全耐药的微小转变过程中的标本)，同时存在敏感菌和耐药菌；目前有学者报道，采用高通量测序技术研究了结核病患者体内MTB异质性耐药的发展过程，发现在INH耐药性产生的早期，同一细菌群体中同时存在4～5 种与INH耐药相关的突变，证实了异质性耐药的真实存在[19-20]。这些可能存在的低比例异质性耐药标本有可能导致分子检测方法的漏检。另外，在某些情况下，笔者认为应对多个平行痰液标本进行DST。Trauner等[21]研究证实，即使在24 h内不同时间获得的3份标本也不均匀，并且可能导致不同的抗性谱，作者进一步认为找到了不恰当的治疗形成MTBC异质性的证据：通过非最佳治疗方案的实施，导致耐药性克隆的出现。这些克隆可能已经存在于宿主MTBC群体内不断产生的遗传多样性中。 这种可能性解释了为什么经常会出现对同一药物具有耐药性的多克隆在患者体内同时产生的情况。笔者的研究也存在一些局限性，由于仅使用MDR-TB的疑似或确诊患者的临床分离株评估探针熔解曲线法，无法将较新或既往治疗患者的耐药率与其他可能的MDR-TB易感原因相关联。因此，有必要进一步研究，从呼吸道样本直接检测MTBC耐药性的影响，并加大样本量进行验证研究，同时结合患者的临床信息进行分析。

探针熔解曲线法系统允许同时检测RFP及INH耐药性相关突变。该系统是基于荧光PCR和熔解曲线分析方法的组合，在设备操作和软件使用方面具有简单快速的特点。同时，该系统的检测结果与常规表型DST试验具有高度的一致性。因此，探针熔解曲线法有望成为临床检测MDR-TB的有力工具。

志谢潍坊医学院陈景武教授对本文统计学分析进行了悉心指导！