常用实验室技术诊断结核性脑膜炎效能的比较研究

郑会强 崔晓利 窦权利 康磊 李爱芳 杨翰 刘元 谈小文 党丽云

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)在结核病中占0.5%～1.0%[1],由结核分枝杆菌(MTB)经血液循环侵入颅内或经其他途径播散至颅内而引起的脑膜、脊膜、脑实质、脑血管等的慢性非化脓性炎症，其发病隐匿，缺乏快速、敏感的诊断方法，导致诊断治疗不及时,因而死亡及致残的发生率较高。

MTB具有抗酸性、多形性、抵抗力强、菌体结构复杂和生长缓慢等特殊的生物学特性[2]，致使TBM的临床表现缺乏特异性，脑脊液、血液等指标变化不明显，病原学检查敏感度不高，难以与病毒性、化脓性、隐球菌性等脑膜炎相鉴别。目前诊断TBM主要依赖于临床症状、影像学表现、脑脊液生化、脑脊液常规、脑脊液培养、抗酸染色、分子生物学，以及免疫学检查等。笔者回顾性分析BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960法”)、改良抗酸染色(简称“MZN法”)、GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert法”)、荧光探针法聚合酶链式反应(简称“PCR-荧光探针法”)和结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)等5种实验室检测技术对西安市胸科医院TBM疑似患者脑脊液进行检测的结果，探讨以上5种方法在TBM早期诊断中的价值。

对象和方法

一、 研究对象

回顾性分析西安市胸科医院2017年1月至2018年4月期间收治的成年疑似结核性脑膜炎患者244例，以2010年国际TBM协作组制定[3]的评分标准(临床评分≥6分)为诊断标准(表1)，最终筛选出104例患者，患者脑脊液均进行上述5种技术检测。104例患者分为4组：(1)确诊组(36例)：符合临床症状和体征，进行脑脊液抗酸染色检查出抗酸杆菌，或者进行脑脊液MTB培养阳性或核酸检测阳性；(2)很有可能组(23例)：符合临床症状和体征，同时临床评分≥10分(无神经影像学表现)或临床评分≥10分(伴有神经影像学表现)；(3)可能组(12例)：符合临床症状和体征，临床评分6～9分(无神经影像学表现)或临床评分6～11分(伴有神经影像学表现)；(4)非TBM组(33例)：不符合国际TBM组制定的评分标准(临床评分<6分)。本研究获得本院伦理委员会的批准，4组患者均签署知情同意书。

确诊组、很有可能组和可能组共71例，作为TBM组；其中，男39例，女32例；年龄18～74岁，平均(34.1±19.2)岁。非TBM组33例患者，包括临床评分<6分的疑似结核性脑膜炎患者18例、化脓性脑膜炎6例、病毒性脑膜炎4例、隐球菌性脑膜炎5例。

二、实验室方法

1. MGIT 960法[4]:仪器为BACTEC MGIT 960液体培养系统(美国BD医疗器械有限公司)，试剂为MGIT液体培养管(美国BD医疗器械有限公司，批号为6140573)，分枝杆菌培养添加剂(美国BD医疗器械有限公司，批号为6293546)等。参照《结核病诊断实验室检验规程》取患者0.5 ml脑脊液接种于加有分枝杆菌培养添加剂的液体培养管中，同时按同样方法接种0.5 ml 1麦氏单位标准菌株(H37Rv)稀释100倍后的稀释菌液(质控样本,6～10 d显示阳性结果则质控合格)，混匀后放入BACTEC MGIT 960液体培养系统，仪器培养报阳后取培养后的菌液行萋-尼抗酸染色，确认是否为抗酸杆菌，然后行MTB抗原检测(MPB64蛋白抗原；杭州创新生物检控技术有限公司)。

2. MZN法[5]：仪器为BX43医用光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，FMV-6微型细胞玻片离心沉淀器，试剂为BASO结核菌染色液(冷染法)(珠海贝索生物技术有限公司，批号为417021)。取患者0.5 ml脑脊液、H37Rv(阳性质控)和已知健康人群痰液(阴性质控)分别加入FMV-6微型细胞玻片离心沉淀器的沉淀管中，50×g离心3 min，保证脑脊液标本中的有形成分完全沉淀至挂胶玻片上；然后将微型细胞玻片浸于甲醛丙酮固定液中30 s；再将固定后的玻片浸泡于0.3% Triton X-100破膜液中30 min，后用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液洗3次；最后行抗酸染色，显微镜下判断是否存在抗酸杆菌。

表1 结核性脑膜炎的临床诊断评分

3.GeneXpert 法[6]：仪器为GeneXpert MTB/RIF分析仪(美国Cepheid公司)，配套试剂为GeneXpert法检测试剂盒(美国Cepheid公司，批号为1000032621)。取患者1 ml脑脊液按试剂盒说明书操作进行标本前处理，然后上机检测，得出结果[循环阈值(cycle threshold，Ct值)小于40结果判定为阳性]。同时根据试剂盒说明书要求，做样本处理质控和探针质控。

4.PCR-荧光探针法[7]：仪器为ABI 7500荧光PCR检测系统(美国应用生物公司)，配套试剂为分枝杆菌核酸检测试剂盒(北京博奥生物科技有限公司，批号为0112161708和0105171801)。取患者1 ml 脑脊液和已知健康人群痰液(阴性质控)按试剂盒说明书要求进行标本前处理，同时取0.5麦氏单位H37Rv菌悬液提取核酸调至1×1010IU/ml作为阳性质控，然后上机检测，扩增曲线呈S型且Ct值小于40结果判定为阳性。

5. T-SPOT.TB[8]：仪器为BX43医用光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，试剂为T-SPOT.TB检测试剂盒(免疫斑点法)(英国牛津公司，批号为TEC208772和TEC333862)。取患者4 ml脑脊液按试剂盒说明书要求进行前处理，同时按试剂盒说明书要求处理阳性对照质控(斑点数超过20个为试验合格)，然后得到保证细胞数量为2.5×106个/ml的标准溶液，上机孵育后斑点计数，得出结果(阳性判断标准：(1)空白对照孔斑点数为0～5个时，且A孔或B孔与空白孔的斑点数的差值≥6；(2)空白对照孔斑点数为6～10个时，且A孔或B孔斑点数≥两倍空白孔斑点数)。

将MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-荧光探针法和T-SPOT.TB等5种实验室技术分为4个组，A组为细菌学方法组，包括MGIT 960法和MZN法；B组为分子生物学方法组，包括GeneXpert法和PCR-荧光探针法；C组为免疫学方法组，包括T-SPOT.TB；D组为联合诊断组，包括以上5种试验；综合比较5种实验室技术诊断TBM敏感度和4种方法组诊断TBM敏感度的差异。

三、统计学处理

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，计数资料以“率(%)”表示，两组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 实验室检查基本情况

均行MGIT 960法、MZN法、GeneXpert法、PCR-荧光探针法和T-SPOT.TB检测的71例患者中，MGIT 960法阳性14例，阴性57例；MZN法阳性19例，阴性52例；GeneXpert法阳性30例，阴性41例；PCR-荧光探针法阳性25例，阴性46例；T-SPOT.TB阳性21例，阴性50例。

以临床诊断为标准，GeneXpert法和PCR-荧光探针法的敏感度高于MGIT 960法，差异均有统计学意义(χ2=8.43，P=0.004；χ2=4.28，P=0.039)；MZN法和T-SPOT.TB试验的敏感度与MGIT 960法比较，差异均无统计学意义(χ2=0.99，P=0.320；χ2=1.85，P=0.242)，见表2。

二、 不同方法组间检测效能的比较

以临床诊断为标准，细菌学方法组、分子生物学方法组、免疫学方法组和联合诊断组的敏感度分别为31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。见表3。分子生物学方法组和联合诊断组的敏感度高于细菌学方法组，差异均有统计学意义(χ2=5.71，P=0.017；χ2=73.20，P=0.000)。

讨 论

TBM是最常见的肺外结核之一，占肺外结核的5%～10%[9]。TBM患者死亡率高，多发生在发病初6个月，病死率可达26.8%[10]，因此早期快速的实验室诊断方法能够为患者的治疗和预后提供较大帮助。目前关于TBM早期快速诊断的实验室方法研究较多，各研究者对细菌学、免疫学、分子生物学等方法的报道不尽相同。

本研究MGIT 960法检测的敏感度为19.7%，Rajeev 等[11]报道MTB培养敏感度为10%～30%，Philip等[12]报道MTB培养敏感度为10%～71%，由此可见，MTB培养敏感度差异较大。本研究考虑到MGIT 960法液体培养阳性只能说明是分枝杆菌复合群，也可能存在非结核分枝杆菌，因此用培养阳性后的菌液做MTB抗原检测试验，确认其为结核分枝杆菌复合群。但是MGIT 960法培养周期长，不能满足TBM的早期快速诊断。脑脊液涂片Z-N法检测的敏感度低，只有10%左右，并且只能检测到细胞外抗酸杆菌[13]，吴海峰[14]报道抗结核药物作用于MTB细胞壁，导致部分MTB的L型(MTB-L)出现，其细胞壁不完整，抗酸染色时细菌体不易着色，或者着色极淡，进而使得抗酸杆菌的检出率降低。因此本研究采用改良抗酸染色法(MZN法)[5]，将患者脑脊液离心、固定、破膜后行抗酸染色，然后显微镜下找抗酸杆菌，最终敏感度为26.8%。此方法能检测细胞内和细胞外的抗酸杆菌，且可在患者接受治疗6.5个月后检出[15-16]，因此MZN法敏感度明显高于Trusov 等[17]报道的传统抗酸染色(Z-N法)10%左右。但是脑脊液抗酸染色是在显微镜下找抗酸阳性杆菌，并不能区分MTB和非结核分枝杆菌，且容易受到标本采集、抗结核药物和实验者主观因素的影响。可见，虽然MZN法敏感度明显高于Z-N法，但仍然不能满足临床需求。

表2 以临床诊断为标准5种实验室检测技术检测104例患者脑脊液的效能比较

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%，特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%,阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%,阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

表3 以临床诊断为标准4种方法组检测104例患者的敏感度

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%

分子生物学方法近年来成为研究热点，2017年新版肺结核诊断标准(《WS 288—2017 肺结核诊断》)[18]中推荐分枝杆菌核酸检测为结核病诊断的参考标准之一。本研究采用PCR-荧光探针法，在常规PCR的基础上，加入荧光探针，把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，保证整个过程在单管中进行，最大限度地降低了PCR产物对实验的污染[19]。最终得出PCR-荧光探针法在TBM诊断中的敏感度为35.2%，高于MGIT 960法的19.7%。Hannan 等[20]报道PCR在MTB的DNA检测中的敏感度为31%～100%，特异度为66%～100%，由于单一的靶基因扩增，某些TBM患者中可能没有这些基因，此外MTB的细胞壁有一个不透水的复杂结构使细胞溶解困难，从而导致核酸含量低，这些因素均可能导致一定的假阴性，因此单一的PCR-荧光探针法试验在TBM的诊断中也存在很多缺点。WHO推荐GeneXpert法检测作为TBM初次检测的优先方案，该方法在TBM的早期诊断中有巨大优势[21-22]。近年来，国内外对GeneXpert法新型分子诊断平台在肺结核、肺外结核、耐药结核病，以及结核病并发HIV感染等疾病中的研究层出不穷。本研究采用GeneXpert法检测的敏感度达42.3%，明显高于MGIT 960法，且与杨元利等[23]报道的采用GeneXpert法在TBM患者脑脊液检测中的敏感度(41%)差距不大，与刘锐等[24]报道GeneXpert法检测TBM的敏感度(43.1%)相差较小。由此可见，GeneXpert法诊断的敏感度优于MGIT 960法，其快速、准确的优点对TBM的早期诊断、治疗和预后帮助很大；同时其可以检测利福平耐药情况。因此，GeneXpert法比较适合在结核病高负担国家推广使用。由于GeneXpert法仅凭单一的靶基因扩增和检测单一的rpoB基因耐药决定区，可能导致产生一定的假阴性，其在TBM的诊断中仍然需要与其他实验室方法联合使用，以提高敏感度、降低假阴性率。

有报道认为，血清学检测方法不能作为诊断结核病的金标准[25]，但是其对菌阴肺结核和肺外结核患者的诊断具有较高的敏感度，2017年新版肺结核诊断标准(《WS 288—2017 肺结核诊断》)[18]中将γ-干扰素释放试验等纳入其中。因此，笔者研究T-SPOT.TB在TBM诊断中的效能，得出其在TBM中的敏感度为29.6%，稍高于MGIT 960法的敏感度。吴长静[26]报道T-SPOT.TB在检测脑脊液中的敏感度达97.1%，段素霞[27]报道T-SPOT.TB检测脑脊液的敏感度为91.1%，笔者得出的敏感度低于以上研究。分析原因主要有两点：一是本研究41例患者标本的单个核细胞数量小于2.5×106个/ml，不符合试验要求，结果判定为阴性，导致敏感度降低；二是由于长时间抗结核药物治疗过程中，MTB效应T细胞存活周期变短，进而导致T-SPOT.TB检测结果呈假阴性。另外，T-SPOT.TB能否区别结核潜伏感染和活动性肺结核仍然有待商榷。总体而言，在TBM患者脑脊液满足实验要求的情况下，T-SPOT.TB试验的敏感度和特异度较高，其在TBM的早期诊断中发挥着较大作用。

在TBM的诊断中，各种实验室检测技术均存在一定不足，MZN法敏感度低，MGIT 960法实验周期长，PCR-荧光探针法和GeneXpert法存在一定的假阴性，T-SPOT.TB对实验标本质量要求较高，且可能无法区分结核潜伏感染和活动性肺结核。因此，笔者尝试研究细菌学方法组、分子生物学方法组、免疫学方法组和联合诊断组的敏感度，得出4种方法组的敏感度分别为31.0%、50.7%、29.6%、73.2%。由此可见，不同检测技术间综合后的敏感度较单一检测技术有所提高，细菌学方法组一定程度上弥补了MZN法敏感度低、MGIT 960法实验周期长的不足，分子生物学方法组一定程度上降低了单一检测技术的假阴性率，联合诊断组大大提升了实验室检测技术在TBM早期诊断中的敏感度，不同程度克服了各单一检测技术的缺点，但是其对患者经济条件要求较高。

综上所述，本研究所采用的5种实验室检测技术在TBM的诊断中各有其优缺点，其中分子生物学方法的敏感度优于MGIT 960法和MZN法，且检测周期短，建议作为TBM早期快速诊断的优选方案。在实际临床工作中，建议根据患者经济条件、抗结核治疗时机、抗结核药物的选择及实验室条件等综合因素，选择合适的联合检测方法，以提高TBM诊断的敏感度，降低各类检测技术诊断的假阴性率，进而最大限度地帮助TBM患者得到早期快速诊断，减少误诊和漏诊，促进对TBM患者进行早期规范的治疗，降低致残率和死亡率，改善TBM患者的预后。