土鳖虫抗兔高胆固醇血症模型内参基因的评估及应用

2019-01-11姜恩泽宁方勇杜智恒白秀娟

东北农业大学学报 2018年12期

张震，姜恩泽，宁方勇，杜智恒，白秀娟

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）高效、灵敏、特异性强，广泛应用于分子诊断、生命科学、农业和医药领域[1]。样品获得和处理、RNA质量和完整性、反转录、PCR效率等影响qPCR结果[2]。因此，qPCR分析数据需标准化处理以提高结果准确性[3]。一般以稳定表达内参基因作为内源性对照[4]。理想内参基因，在组织类型和试验中必须稳定表达。研究表明，内参基因（Gapdh和Actb等）在不同物种、组织类型、细胞系、发育阶段和试验中非恒定表达，不存在理想通用内参基因[5-6]。因此，依据不同条件选择合适内参基因，对qPCR分析结果准确性十分重要。

高胆固醇血症（Hypercholesterolaemia）属于血脂异常症，表现为血清总胆固醇水平（TC）偏高，引起动脉粥样硬化、诱发心肌梗死、中风和脑卒中等疾病，应高度重视高胆固醇血症预防和治疗[7]。目前，高胆固醇血症治疗药物主要为他汀类、贝特类等西药，作用单一，易引起不良反应，副作用较强。中药治疗优点为药源丰富、不良反应小、多靶点等，降胆固醇类中药研究日益增多。土鳖虫（Eupolyphaga steleophaga）是传统中药，为鳖蠊科（Corydiidae）昆虫地鳖（Eupolyphaga sinensis Walker）或冀地鳖（Steleophaga plancyi Boleny）雌虫干燥体。赵德忠、王征等报道土鳖虫可调节肥胖大鼠血脂[8-9]；赵志壮等应用qPCR技术进一步探讨土鳖虫冻干粉治疗高脂血症家兔作用机制[10]。应用qPCR技术可加快土鳖虫抗胆固醇药理作用分子机制研究，但目前尚无该模型相关内参基因评估。本文旨在使用5种不同算法GeNorm,BestKeeper,NormFinder，ΔCt和RefFinder评估9个常用内参基因（Actb、B2m、Eef1a1、Gapdh、Hprt1、Ppia、Rpl5、Sdha、Ywhaz）在土鳖虫抗兔高胆固醇血症模型肝脏中表达稳定性，为该模型提供合适内参基因；应用最稳定内参基因标准化Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表达，从分子水平研究土鳖虫调节胆固醇机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

60只2月龄雄性哈白兔，体重（2.0±0.25）kg，购自华强皮草开发有限公司。

1.2 主要仪器

7500型实时荧光定量PCR仪，购自美国应用生物系统公司（ABI）；离心机，购自上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计和高速冷冻离心机，购自Eppendorf（中国）有限公司。

1.3 药物与试剂

土鳖虫粉购自黑龙江省哈尔滨市中药材大市场；组织RNA提取试剂盒，购自OMEGA公司；反转录试剂盒和荧光定量试剂盒，购自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 分组、模型制备和样品采集

单笼饲养、自由饮水预饲基础饲料7 d后，60只雄性哈白兔随机分为2组，空白组15只，饲喂基础饲料；高胆固醇血症组45只，饲喂高胆固醇饲料（79%基础饲料+1%胆固醇+10%猪油+10%蛋黄粉），制备高胆固醇血症兔，制备期8周。每2周称重1次，每组随机抽取5个样本检测12 h空腹血清胆固醇以监测造模情况，8周结束时，检测所有个体重和12 h空腹血清胆固醇。

将高胆固醇血症兔随机分为3组，对照组11只，高、低剂量给药组各12只。高、低剂量给药组分别饲喂含有0.4和0.2 g·kg-1土鳖虫粉基础饲料，空白组和对照组饲喂基础饲料，治疗期6周。于治疗期第3周，各组随机抽取3只检测12 h空腹血清胆固醇。治疗结束时，分别取空白组、对照组和高、低剂量给药组各10只检测12 h空腹血清胆固醇，处死后迅速取肝组织分装于冻存管置于液氮速冻，-80℃冰箱保存。

1.5 RNA提取及反转录

按OMEGA组织RNA提取试剂盒说明书提取肝组织总RNA，使用紫外分光光度计检测RNA纯度并计算浓度。按全式金反转录试剂盒说明反转录，反转录体系为：总RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10 μL，Anchored Oligo（dT）1 μL，Trans Script RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，补足RNase-Free Water至20μL，混匀。反转录条件为：45℃30 min，85℃5 s。所获cDNA 5倍稀释后用于qPCR分析。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）分析

引物序列见表1。反应体系10μL，包括：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 5μL， Passive Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，补足ddH2O至10μL。反应条件为：50℃ 2 min；95℃ 30 s；（95℃ 5 s，60℃ 30 s）×40个循环；95℃ 15 s；60℃1 min;95℃30 s。每个样品3次重复，Ct取平均值。

表1 引物序列和特点Table1 Primer sequences and character

1.7 数据处理与分析

采用SPSS24.0中ANOVA模型LSD法分析不同组间血清总胆固醇水平（TC）和胆固醇相关基因表达差异。使用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法评估内参基因稳定性。采用2-ΔΔCt法分析肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1 基因相对表达比率。

GeNorm依据Ct值计算每个内参基因（基因个数≥3）组内配对变异值，该值为基因稳定量度值（M值，M值＜0.5内参基因较稳定），M值为内参基因稳定值，M值越小内参基因越稳定。GeNorm配对分析标准化因子n（NFn）和标准化因子n+1（NFn+1），分析结果定义为Vn/n+1，当Vn/n+1＜0.150时，最佳内参基因数量为n，即无须使用n+1个内参基因保证数据可靠性。）和NFn+1）分别代表n和n+1个M值几何平均数，其中n为M值序列号[11]。BestKeeper依据Ct值描述性统计分析内参基因（基因个数≤10），分析结果中标准偏差值（SD值＜1内参基因较稳定）为内参基因稳定值，SD值越小内参基因越稳定[12]。NormFinder依据Ct值计算每个内参基因（基因个数≥8）组内变异和组间变异，并将组内变异和组间变异值合并，定义为内参基因稳定值，对应内参基因稳定性，稳定值越小内参基因越稳定[13]。ΔCt算法依据Ct值计算配对内参基因（基因个数≥3）组内平均标准偏差值（SD平均值），SD平均值为内参基因稳定值，值越小内参基因越稳定[14]。RefFinder依据以上4种算法计算每个内参基因几何平均数加权值（GM值），GM值为内参基因稳定值，值越小内参基因越稳定[15]。

2 结果与分析

2.1 各阶段血清总胆固醇（TC）水平

共制备高胆固醇血症兔35只，空白组（n=15）与高胆固醇血症型组（n=35）差异极显著（P＜0.01），表明制备成功。治疗结束时，空白组（n=10），高（n=10）、低（n=10）剂量给药组与对照组（n=10）差异极显著（P＜0.01），各给药组与空白组差异不显著（P>0.05），各给药组间差异不显著，表明2种土鳖虫剂量均可降低血胆固醇（见表2）。

表2 土鳖虫对高胆固醇血症兔血清总胆固醇的影响Table2 Effectsof eupolyphaga on total cholesterol of rabbitswith hypercholesterolaemia (mmol·L-1)

2.2 肝脏中内参基因稳定性

肝脏中5种算法评估9个内参基因稳定性见表3，确定各种算法中4个最稳定内参基因。GeNorm评估4个最稳定内参基因为：B2m=Ywhaz>Ppia>Eef1a1，BestKeeper评估4个最稳定内参基因为：B2m>Ywhaz>Ppia>Eef1a1，NormFinder评估 4个最稳定内参基因为：Gapdh>Sdha>Eef1a1>Ppia，ΔCt评估4个最稳定内参基因为：Gapdh>Eef1a1>Sdha>Ppia，RefFinder评估4个最稳定内参基因为：Gapdh>B2m>Ywhaz>Eef1a1。结果表明，每种算法评估最稳定内参基因不同，BestKeeper和GeNorm评估结果中3个基因（B2m,Ywhaz,和Eef1a1）与RefFinder相同，ΔCt和NormFinder结果中2个基因（Gapdh和 Eef1a1）与RefFinder相同。5种算法中Hprt1、Actb和Rpl5均为不稳定内参基因，表明其在模型中表达不稳定，不适合标准化该模型qPCR数据。

综上分析，5种算法结果差异较小，整体趋势接近一致。综合各算法结果，4个较稳定内参基因为：Gapdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1，3个最不稳定内参基因为：Hprt1、Actb和Rpl5。

表3 肝脏中五种算法评估结果Table 3 Evaluation results of reference genes by fivedifferent algorithmsin theliver

2.3 肝脏中最稳定内参基因

GeNorm计算配对变异Vn/n+1值并比较给定阈值0.150，确定最佳内参基因数量。肝脏中配对变异Vn/n+1值见图1。结果显示，肝脏中所有Vn/n+1值均小于0.150，表明n取最小值即满足算法，因此肝脏中最佳内参基因数量为2。

综合内参基因稳定性排序和最佳内参基因数量，肝脏中最稳定内参基因为Gapdh和B2m。

2.4 土鳖虫对肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表达的影响

使用Gapdh和B2m标准化肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表达结果见表4。

图1 GeNorm确定4种组织中最佳内参基因数Fig.1 Determination of the optimal number of referencegenesin thefour tissues using the GeNorm algorithm

表4 肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表达水平Table 4 Expression level of Lxrα、Abca1 and Cyp7a1 in liver

肝LxrαmRNA表达水平，对照组与其他组差异显著（P＜0.05），各给药组与空白组差异不显著（P>0.05），给药组间差异不显著（P>0.05）。结果表明，土鳖虫可上调高胆固醇血症兔肝LxrαmRNA表达，上调效果高剂量略高于低剂量。

肝Abca1 mRNA表达水平，对照组与其他组差异显著（P＜0.05），各给药组与空白组差异显著（P＜0.05），给药组间差异不显著（P>0.05）。结果表明，土鳖虫可上调高胆固醇血症兔Abca1 mRNA表达，上调效果高低剂量接近一致。

肝Cyp7a1 mRNA表达水平，对照组与其他组差异显著（P＜0.05），高剂量给药组与空白组差异不显著（P>0.05），低剂量给药组与空白组差异显著（P＜0.05），给药组间差异不显著（P>0.05）。结果表明，土鳖虫可上调高胆固醇血症兔肝Cyp7a1 mRNA表达，上调效果高剂量略高于低剂量。

3 讨论

正常兔血浆胆固醇水平较低，对饲料中胆固醇敏感，饲喂含0.3%～2%胆固醇和4%～8%脂肪饲料4周后，血浆胆固醇水平快速提升[16]。因此，兔成为降脂药物研究重要试验动物[17-18]。本研究中，哈白兔血清胆固醇水平快速提升，可用于制备高胆固醇血症兔模型，但制备成功率未达100%，可能为环境、年龄、品系等因素造成[19]。王玉明等研究发现，土鳖虫可降低高脂血症小鼠血清胆固醇浓度[20]；张晶等在Ⅱ型糖尿病大鼠研究中也得到类似结果[21]。本研究结果显示，给药组与对照组差异极显著（P＜0.01），表明高、低剂量土鳖虫粉均可降低高胆固醇血症兔血清胆固醇，与白秀娟等研究结果相似[22]。

qPCR是检测基因表达重要技术，选择稳定内参基因可保证qPCR结果准确，组织类型和试验条件影响内参基因稳定性。Nachar等研究表明，不同内参基因在兔左心室舒张功能紊乱模型中稳定性不同[23]；陈瑞等研究表明，兔不同发育阶段和组织最稳定内参基因不同[24]。本研究结果表明，不同内参基因在模型肝脏中稳定性不同，Gapdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1较Hprt1、Actb和Rpl5更稳定。不同算法评估内参基因稳定性存在差异。Almeida-Oliveira等研究表明，在高胆固醇血症小鼠脂肪组织中，GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法评估内参基因稳定性结果不同[25]。5种算法结果差异原因为算法原理不同，GeNorm和ΔCt为组内变异比较；BestKeeper为简单统计描述；NormFinder为组内组间变异比较；RefFinder为几何平均数加权计算，不具有生物学意义。本研究中，尽管5种算法评估内参基因结果不同，但差异较小，表明各算法评估结果均具有一定准确性，综合5种算法结果更准确，与Almeida-Oliveira等评估结果一致[26]。为提高试验效率，计算最佳内参基因数量十分重要。Vandesompele等研究表明，最佳内参基因数量不可小于2个[11]。GeNorm可确定试验所需最佳内参基因数且数量不小于2个，董晓丽等使用GeNorm确定免疫刺激后小鼠肝脏最佳内参基因数量为2个[26]。本研究中，适用模型肝脏最佳内参基因数量为2个，符合最佳内参基因数量要求。综合5种算法，土鳖虫抗哈白兔高胆固醇血症模型肝脏最稳定2个内参基因为Gapdh和B2m，可保证qPCR数据准确性又兼顾时间、成本等因素，符合其试验研究发表最少信息指南（MIQE指南）[2]推荐策略。

探讨土鳖虫调节胆固醇机制，应主要研究影响胆固醇代谢的关键基因。冷雪冰等研究表明，土鳖虫可上调高血脂家兔Apo E和LDL-R基因表达量[27]；李洪萍等研究表明土鳖虫冻干粉可下调高血脂肉兔肝脏SR-BI基因表达[28]。目前，尚无其他相关基因表达研究。ATP结合盒转运体A1（Abca1）为膜转运体ABC家族成员，高表达于肝肾等组织，主要功能为调控胞内胆固醇转运至胞外和高密度脂蛋白（HDL）产生，加快胞内胆固醇外排而降低胞内胆固醇浓度[29]。细胞色素7A1（Cyp7a1）酶是一种微粒酶，仅在肝脏中表达，为催化胆汁酸经典合成途径限速酶，Cyp7a1基因表达提高后，增强胆固醇向胆汁酸转化，降低体内胆固醇累积[30]。肝X受体α（Lxrα）为核受体家族Lxrs亚型之一，高表达于肝脏等组织，可调控Abca1和Cyp7a1基因表达，为调节肝脏胆固醇代谢重要基因[31]。本研究结果表明，治疗结束时，与模型组比较，各给药组均可显著上调Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表达（P＜0.05），与白秀娟等[32]发现土鳖虫可上调高血脂症家兔HDL类似，表明提高胆固醇外排和转化相关基因表达可能为土鳖虫治疗高胆固醇血症分子机制。土鳖虫成分复杂，其调节胆固醇分子机制尚待深入。