黑豆淀粉酶解工艺研究

罗仓学， 张春芳

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

黑豆中蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素、微量元素和粗纤维含量丰富.中医认为黑豆有活血、利水、祛风、解毒之功效，基于以上保健功能，黑豆常被加工为保健产品[1].黑豆淀粉含量可达30%[2]，糊化温度为78℃，是很好的碳水化合物来源.黑豆淀粉在一些产品加工(如黑豆豆浆[3]、黑豆酸奶[4]、黑豆多肽保健饮品[5]等)中作为废渣被浪费.目前有关淀粉酶解方面的研究较多，如黄旖旎等[6]用α-淀粉酶酶解百合淀粉，毕金峰等[7]用α-淀粉酶酶解玉米淀粉等，黑豆淀粉研究较少，其主要原因是黑豆淀粉含量低为3～30%[8,9]，常见的淀粉提取法湿磨法[10]和酶解法[11]淀粉提取率较低为50%左右[12]，不利于黑豆淀粉提取，所以黑豆淀粉糊化温度对淀粉酶解效果的研究更少.一般淀粉糊化是在低于100℃温度下进行，此温度是否为最利于淀粉酶解的预处理温度并未有相关报道.

本文主要对比了黑豆淀粉在100℃以下和100℃以上高温糊化对淀粉酶解率的影响，并通过响应面优化α-淀粉酶酶解工艺，旨在获得较高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆淀粉利用率.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-淀粉酶 ，丹麦诺维信酶制剂公司；食用调和植物油，益海嘉里食品工业有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、亚甲基蓝、冰乙酸、葡萄糖、酒石酸钾钠，天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

220V-AC万用电炉，北京科伟永兴仪器有限公司；FA2104S分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；U610052单道可调式移液器，上海普林斯顿生物科技发展有限公司；101-2型干燥箱，上海新苗医疗器械有限公司； PB-10Sartorius pH计，德国赛多利斯集团； MJ-BL25B36粉碎机，广东美的集团股份限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器、DF-1集热式恒温磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司.

1.3 实验方法

1.3.1葡萄糖含量测定

将黑豆酶解液在沸水浴中灭酶10min，等温度降至60℃，3000r/min离心10min，根据GB/T5009.7-2016中方法测上清液中葡萄糖(以还原糖计)含量.

1.3.2淀粉酶解率测定方法

将1.3.1葡萄糖含量测定过程中离心后的上清液测定体积，并将葡萄糖含量和体积代入式(1).

(1)

式(1)中：m为葡萄糖当量等于葡萄糖含量与酶解液质量乘积，g；0.9为还原糖转化为淀粉含量的系数；M为黑豆重量，g；0.28为该黑豆样品中淀粉含量为28%.

1.4 糊化温度对黑豆淀粉酶解率的影响

取黑豆5g和50mL纯净水于带橡胶塞的圆底烧瓶，选择糊化温度为68℃、78℃、98℃、108℃、118℃、128℃在油浴锅中加热20min，待黑豆糊中心温度降至65℃时加入α-淀粉酶，酶解条件：加酶量30μL、酶解pH值6.0、酶解温度65℃，酶解时间1h，沸水浴加热10min灭酶，测定不同糊化温度下的淀粉酶解率，确定最佳糊化温度，以上实验均重复三次.

1.5 α-淀粉酶酶解实验

取黑豆5g按质量比1∶10加入纯净水在55℃下浸泡5h，按1.4优化的糊化温度在带有搅拌器的加热容器中糊化1h，进行以下单因素实验和响应面实验.

1.5.1α-淀粉酶酶解单因素实验

固定酶解温度为65℃，加酶量为30μL，酶解时间为2h，以淀粉酶解率为指标观察不同酶解pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)对淀粉酶解率的影响；固定酶解温度为65℃，酶解时间为2h，酶解pH值为6.0，观察不同加酶量(10μL、20μL、30μL、40μL、50μL)对淀粉酶解率的影响；固定加酶量为30μL，酶解温度为65℃，酶解pH值为6.0，观察不同酶解时间(1h、2h、3h、4h、5h)对淀粉酶解率的影响；固定加酶量为30μL，酶解pH值为6.0，酶解时间为3h，观察不同酶解温度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)对淀粉酶解率的影响，以上实验均重复三次.

1.5.2α-淀粉酶响应面优化实验

采用Box-Benhnken中心组合实验设计，在单因素实验基础上，固定酶解时间为3h，选取酶解pH、加酶量、酶解温度对淀粉酶解率影响较大的三个因素，建立三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验，以淀粉酶解率为响应值，进行实验，以上实验均重复三次.实验设计详见表1所示.

表1 响应面实验设计水平

1.6 验证实验

将黑豆分别在最佳糊化温度和78 ℃下糊化后，在最佳酶解条件下酶解，对比响应面软件所得预测值与真实值之间的误差及通过比较78 ℃和最佳糊化温度糊化后淀粉酶解率，得高温糊化对淀粉酶解率的影响，以上实验均重复三次.

2 结果与讨论

2.1 糊化温度对黑豆淀粉酶解率的影响

由图1可知，当糊化温度范围在78 ℃～98 ℃时，淀粉酶解率基本不变.温度高于108 ℃时，淀粉酶解率迅速增加并随着温度升高趋于稳定.魏毛毛[13]比较了常见的八种淀粉，发现其中绿豆直链淀粉含量最高为37.0%，95 ℃处理下，其膨胀体积最低.黑豆淀粉中直链淀粉含量为45.5%[14]，所以推断出黑豆淀粉膨胀能力较弱，需要高温才能使其淀粉颗粒完全破坏.当温度大于108 ℃淀粉颗粒才能充分吸水膨胀，淀粉酶解率迅速增加到50%左右并趋于稳定.为了节约资源，所以108 ℃为最佳糊化温度.

图1 糊化温度对淀粉酶解率的影响

2.2 α-淀粉酶酶解实验结果分析

2.2.1α-淀粉酶单因素实验结果分析

(1)酶解pH值对淀粉酶解率的影响

由图2可知，酶解pH在5.0～6.0范围内，淀粉酶解率逐渐增大，酶解pH为6.0时淀粉酶解率达到最大，酶解pH在6.0～7.0之间淀粉酶解率基本保持稳定，说明酶解pH在6.0～7.0之间酶活力稳定，此时的酶解离状态最有利于酶与底物结合.酶解pH在7.0～8.0范围内，淀粉酶解率逐渐降低.原因可能是pH 值影响酶活性中心上必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态，从而影响酶与底物的结合[15]，因此酶解 pH 值在6.0～7.0为最佳.

图2 酶解pH对淀粉酶解率的影响

(2)加酶量对淀粉酶解率的影响

由图3可知，随着加酶量的增加淀粉酶解率逐渐增加，这是因为反应起始时淀粉过量，加酶量与酶促反应速度成正比.当加酶量增加至30μL时，淀粉酶解率达到最大值，大于30μL后淀粉酶解率略有下降，原因是酶与淀粉反应为可逆反应，当还原糖积累到一定程度时，加速了逆反应，更多最终产物转化为中间产物，抑制正反应进行，因此淀粉酶解率略有降低[16].所以最佳加酶量为30μL.

图3 加酶量对淀粉酶解率的影响

(3)酶解时间对淀粉酶解率的影响

由图4可知，在0～3 h范围内淀粉酶解率随着酶解时间的增加而增加.当酶解时间大于3 h时，淀粉酶解率基本稳定不变，原因可能是底物逐步被酶解，淀粉酶解率趋于稳定，也可能是酶解时间的增加，导致酶活力逐渐降低，产物逐步积累，对酶解作用产生抑制，淀粉酶解率趋于稳定.所以最佳酶解时间为3 h[17].

图4 酶解时间对淀粉酶解率的影响

(4)酶解温度对淀粉酶解率的影响

由图5可知，酶解温度在55 ℃～65 ℃之间淀粉酶解率缓慢增加，在65 ℃～70 ℃之间，淀粉酶解率基本保持稳定，高于70 ℃后淀粉酶解率迅速降低.这一现象与酶促反应的普遍规律相吻合.酶解温度对酶促反应的影响有两方面.一方面，当酶解温度升高，单位时间内的有效碰撞次数增加，反应速度增快，达到最佳温度范围后反应速度保持稳定；另一方面，酶本质是蛋白质，酶解温度高于该酶所能承受的最大温度后，随着酶解温度升高，酶发生变性失活淀粉酶解率迅速降低[18]，所以最佳酶解温度为70 ℃.

图5 酶解温度对淀粉酶解率的影响

2.2.2 响应面实验方案设计及结果分析

根据单因素实验结果，由Design-Expert 8.0.6统计软件设计实验方案.以淀粉酶解率为响应值，以加酶量(A)、酶解pH(B)酶解温度(C)为自变量，进行三因素三水平中心组合实验，其结果如表2所示.

表2 响应面实验设计及酶解结果

(1)回归方程拟合及方差分析

采用Design Expert 8.0.6统计软件对所得数据进行回归分析，回归方程结果如表3所示.对各因素回归拟合后，得到回归方程：淀粉酶解率=54.80+2.29A+1.89B-0.47C-1.59AB-0.58AC+1.23BC-1.75A2-5.06B2-2.14C2回归模型的R2=0.988 8，RAdj=0.968 5由方差分析可知回归方程模型显著(p<0.05),说明该模型与实际拟合良好，实验方法可靠，失拟项不显著(p>0.05)，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析.结果表明，加酶量(A)、酶解pH值(B) 、加酶量与酶解pH值交互项(AB)、 酶解pH值与酶解温度交互项(BC)、加酶量二次项(A2) 、酶解pH值二次项(B2)、酶解温度二次项(C2)对应响应值显著，根据P得各因素显著性的排序为A>B>C.根据软件所建立的数学模型进行参数最佳化分析，得α-淀粉酶最佳酶解工艺为：加酶量33.29μL、酶解温度 69.09 ℃、酶解pH6.03、酶解时间3 h，淀粉酶解率预测值为54.80%.

注：**p<0.01为极显著；*p<0.05为显著.

(2)响应面图分析

根据软件Design-Expert 获得响应值的3D曲面，分析各因素对淀粉酶解率的影响及各因素间的交互作用.图6所示固定加酶量，酶解pH值，酶解温度中的任意一个因素为零水平时，观察其余两个因素间的交互作用及对淀粉酶解率的影响.淀粉酶解率随其中任意两个变量的增加均呈上升趋势，达到某一定值时，曲面稍下降或趋于平缓.由图6可知，曲面陡峭，说明加酶量和酶解pH之间交互作用明显，与方差分析结果一致.

图6 两因素的交互作用对淀粉酶解率的响应面图

2.3 验证实验

考虑到实际操作条件，将黑豆酶解工艺调整为：加酶量33μL、酶解温度69 ℃、酶解pH6.0、酶解时间3 h.由表4验证实验结果可得：黑豆在最佳糊化温度108 ℃下糊化，用最佳酶解工艺酶解淀粉酶解率达53.10±2.3%，与预测值误差为3.20±0.04%.相比黑豆在78℃下糊化，黑豆在108 ℃下糊化淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.

表4 验证实验

3 结论

由以上实验可知，黑豆淀粉糊化温度为108 ℃时，最益于α-淀粉酶酶解.在108 ℃下糊化后，通过响应面法优化α-淀粉酶酶解工艺，得最佳酶解工艺：加酶量33μL，酶解温度69 ℃，酶解pH6.0，酶解时间3 h.通过验证实验得黑豆108 ℃下糊化，与78 ℃下糊化相比,淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.通过本实验获得了较高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆利用率，避免了资源浪费.