细菌纤维素/胶原蛋白多孔微球的制备及性能
2019-01-11王学川强涛涛李曦月
张 雯， 王学川， 强涛涛， 李曦月， 高 畅
(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西科技大学 轻工科学与工程学院， 陕西 西安 710021)
0 引言
组织工程作为一门研究和开发具有修复和改善损伤组织功能生物替代物的新兴科学，在组织修复、器官修复重建方面发挥着举足轻重的作用.该技术目前在骨组织工程、人造血管、人造皮肤等领域备受关注.其中作为体外细胞培养载体的新型支架材料也成为了研究热点.目前主要的支架形式有水凝胶[1]、纤维[2]和多孔结构[3]3种.其中，多孔微球作为一种重要的新型材料，具有密度低、比表面积大、稳定性好和表面渗透能力强等特点[4].与传统细胞培养方法相比，能更好地模拟复杂的生理环境，便于悬浮培养和提高细胞的表达水平[5]，因此是目前公认的最有发展前途的一种组织工程支架，并且已经应用于细胞的大量培养中[6,7].
胶原蛋白(Collagen,COL)是细胞外基质和连接组织(包括韧带、腱、软骨、骨、角膜和皮肤等)的主要成分，一般呈网络状或纤维状，提供物理支撑以维持细胞和组织的结构完整性[8].胶原蛋白基复合材料由于其优良的生物相容性和生物可降解性，在组织工程支架、伤口敷料、人造血管、人造皮肤等生物医学领域有着广泛应用.在实际应用过程中，可通过交联、混入其它天然和合成高分子或功能无机物等方法制备复合材料，以增强其力学强度，提高热性能以及生物稳定性，进而实现更多的结构和功能调控[8].细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)是指由生长在液态含糖基质中的细菌产生，并分泌到基质中的纤维素，是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物.BC具有高结晶度、高持水性、三维网状结构、高抗张强度和弹性模量等特性[9]，同时还具有良好的生物相容性[10,11]和可降解性[12,13]，目前已成为国际上新型组织工程材料的研究热点.
基于组织工程技术在医药领域的巨大应用前景，以及COL-BC基多孔微球作为组织支架所具有的优势，本研究以COL和BC为基体，进行COL、BC的复合，制备BC/COL多孔微球，并对其性能进行研究，为其应用于组织工程支架奠定基础.
1 实验部分
1.1 材料
1.1.1菌种
木醋杆菌(AcetobacterXylinum)，陕西科技大学制药工程实验室提供.
1.1.2培养基
(1)种子培养基：蔗糖6%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，柠檬酸0.08%，无水乙醇1.0%.
(2)发酵培养基：蔗糖6%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，柠檬酸0.08%，琼脂1.8%，无水乙醇1.0%.
其余试剂均采用国产分析纯或生化试剂.
1.2 仪器设备
S-4800电镜扫描仪,日本日立公司；D/max2200PC全自动X-射线衍射仪，日本Rigalcu；VERTEX70傅立叶变换红外光谱仪，德国Brucher公司；STA449F3-1053-M热重分析仪，德国耐驰仪器制造有限公司；马尔文MS2000激光粒度仪，英国Mastersizer；MG250B恒温培养箱、HYG-1A恒温振荡器，上海新瑞仪器有限公司.
1.3 实验方法
1.3.1BSA含量测定
分光光度法.
1.3.2FIIR检测
将BC膜、COL膜和BC/COL复合膜，在VERTEX70傅立叶变换红外光谱仪上进行测定.波数范围：600～4000cm-1，波数精度：0.01cm-1，分辨率：优于0.09cm-1.
1.3.3XRD测定
采用D/max2200PC X 射线衍射仪分析BC膜、COL膜和BC/COL复合膜结晶结构，工作电压40kV，电流20mA，λ=0.154nm，Cu靶，Ni过滤片，扫描速度8°/min，扫描范围5°到60°，步长0.02°.
1.3.4SEM测定
将干燥BC膜、COL膜和BC/COL复合膜进行喷金处理，用S-4800型扫描电子显微镜进行观察并拍照.
1.3.5热稳定性(TG-DSC)分析
采用STA449F3型的热分析仪分析BC膜、COL膜和BC/COL复合膜热稳定性，测试条件温度范围0～800℃，升降温速率10℃/min，称量范围5～10mg(小样品坩埚)，氮气气氛.
1.4 BC发酵
利用AcetobacterXylinum发酵制备BC，分别进行斜面培养(30℃恒温培养箱中培养2～3d)、种子液制备(30℃恒温培养箱中培养1d，培养液置于30℃，160r/min摇床震荡30min释放菌体细胞)、发酵培养(装液量30mL/250mL三角瓶，接种量20%，30℃恒温培养箱中静置培养).发酵结束后取BC膜用去离子反复冲洗，直到pH为7.0，冷冻干燥[13].
1.5 BC/COL复合膜的制备
1.5.1DABC的制备
称取1g BC悬浮于250mL去离子水中，高速匀浆机匀浆后转移至500mL圆底烧瓶中，加入0.5g高碘酸钠，锡箔纸包裹，50℃下氧化10h.反应结束后抽滤，沉淀中加入50mL0.1mol/ L 乙二醇溶液继续反应1h，反应结束后抽滤，去离子水洗涤沉淀物5次，收集沉淀，冷冻干燥得DABC[1].
1.5.2CDABC的制备
称取1.5g胶原蛋白分散于180mL去离子水中，45℃水浴缓慢搅拌至体系均匀得COL凝胶液，继续水浴1h.取0.5g DABC分散于180mL去离子水中，45℃水浴1h.COL凝胶液与DABC分散液混合，玻璃棒缓慢搅拌20min.混合凝胶室温下抽滤，45℃热水反复洗涤沉淀物去除未反应COL，冷冻干燥得CDABC复合材料.
1.6 BC/COL多孔微球制备
称取一定质量CDABC，90℃下溶解于5g离子液中，得CDABC/IL溶液.按一定比例混合IL相(CDABC/IL溶液)与有机相(十六烷)，加入复合表面活性剂(司盘∶吐温=1∶1)，一定温度下搅拌乳化形成乳液.在乳液中加入正丁醇50mL，搅拌3h后静置2h，待沉淀完全，抽滤收集微球沉淀.依次采用50mL正丁醇，50mL丙酮，50mL蒸馏水洗涤微球，冷冻干燥得BC/COL多孔微球.在实验过程中，考察CDABC质量分数分别为3%、4%、5%、6%、7%，十六烷∶(CDABC/IL)分别为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，乳化时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，乳化温度分别为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃等时对BC/COL多孔微球载药性能的影响.根据单因素实验结果选择合适的因素水平进行正交试验.
1.7 BC/COL多孔微球的性能
利用FTIR、XRD、SEM、TG-DSC检测技术分别对BC、DABC、CDABC和BC/COL多孔微球进行现代分析仪器检测，研究其材料学特性.
2 结果与讨论
2.1 BC/COL多孔微球制备工艺
2.1.1BC/COL多孔微球制备工艺单因素实验结果
BC/COL多孔微球制备工艺单因素实验结果如图1～8所示.图1及图2所示为CDABC质量分数对BC/COL多孔微球制备的影响.由图1可以看出，随着CDABC质量分数的增加，BC/COL多孔微球载药率呈先上升后下降的趋势，当CDABC的质量分数为4%时，BC/COL多孔微球载药率最高.
由图2粒径分析可知，CDABC的质量分数为4%时所制备的BC/COL多孔微球粒径最接近正态分布，说明此条件下所制备多孔微球形态规整，分布均匀.质量分数过低或过高时，易导致所制备多孔微球球体不完整，或内部结构过于致密，影响其载药性能.
图1 CDABC质量分数对BC/COL多孔微球制备的影响
图2 不同CDABC质量制备BC/COL多孔微球粒径分析
图3及图4所示为乳化时间及乳化温度对BC/COL多孔微球制备的影响.微球制备过程中，CDABC/IL溶液以液滴的形式分散于十六烷相，该稳定W/O乳液的形成对微球的制备起决定性作用.乳化过程中，乳化时间和乳化温度对乳液稳定性均有影响.由图3及图4可知，乳化时间小于4h，乳化温度高于35℃均不利于稳定乳液的形成，继而影响微球载药性能.图5及图6所示，微球粒径分布也表明在此较优工艺下所制备的BC/COL多孔微球粒径均匀，呈正态分布，与载药效果一致.
图3 乳化时间对BC/COL多孔微球制备的影响
图4 乳化温度对BC/COL多孔微球制备的影响
图5 不同乳化时间制备BC/COL多孔微球粒径分析
图6 不同乳化温度制备BC/COL多孔微球粒径分析
图7、图8所示为十六烷/(CDABC/IL)比例对BC/COL多孔微球制备的影响.实验结果表明，十六烷∶(CDABC/IL)为10∶1时，BC/COL多孔微球载药率较高，微球粒径分布效果较好，说明此工艺下所形成的W/O乳液稳定性较好，所制备微球性能良好.
图7 十六烷∶(CDABC/IL)对BC/COL多孔微球制备的影响
图8 不同十六烷∶(CDABC/IL)比例制备BC/COL多孔微球粒径分析
2.1.2BC/COL多孔微球制备工艺正交试验结果
根据单因素实验结果设计正交试验，如表1所示.
表1 正交试验设计
正交试验结果如表2所示.试验结果表明，对BC/COL多孔微球制备影响显著性依次为CDABC质量分数>十六烷∶(CDABC/IL)>乳化温度>乳化时间.最优工艺为A2B3C2D2，即乳化温度35 ℃，乳化时间5 h，十六烷∶(CDABC/IL)=10∶1，CDABC质量分数4%.在此工艺下制备BC/COL多孔微球，其载药率为254 mg/g.
表2 正交试验结果及分析
2.2 BC/COL多孔微球的性能
2.2.1 红外光谱分析(FT-IR)
图9所示为BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球红外图谱.BC[14]的红外图谱中3 354 cm-1处为O-H 的伸缩振动吸收峰，说明分子中含有大量的-OH；2 885 cm-1附近为C-H伸缩振动吸收峰；1 419 cm-1、1 311 cm-1附近为C-H弯曲振动特征峰；1 103 cm-1、1 055 cm-1以及 1 031 cm-1处为醇中的 C-O 的伸缩振动特征峰[13].图谱所示BC可能存在的有机化合物基团有：-OH、-CH2、C-H、C-O等，与标准BC的结构相符合.COL的红外图谱中[15]，1 659 cm-1为酰胺I的吸收峰，1 552 cm-1为酰胺II吸收峰，1 240 cm-1为酰胺Ⅲ吸收峰，谱带酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ谱带为胶原蛋白的特征吸收峰，这表明COL三股螺旋结构的存在.DABC的红外图谱中，2 721 cm-1是醛基C-H键的吸收峰，1 728 cm-1是C=O键的特征吸收峰，表明BC中部分-OH被氧化成了醛基.CDABC红外图谱中，3 348 cm-1处的吸收峰反映了分子间氢键引起的-CHO基的伸缩振动， 1 690～1 590 cm-1之间的吸收峰是由-C=N-的振动引起的，1 541 cm-1为-NH的变形振动，1 300～1 000cm-1之间的吸收峰是由醚的伸缩振动引起的，670cm-1为N-H面外弯曲振动，证明了CDABC的生成.BC/COL多孔微球红外图谱与CDABC红外图谱相似，表明微球制备过程中仅为材料形态的改变，无化学反应发生.
2.2.2 X射线衍射仪分析(XRD)
图9 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球红外图谱
图10 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球XRD图谱
2.2.3 热稳定性(TG)分析
图11、图12分别为BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球的TG曲线及DTG曲线.由图11、12可知，BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球均存在三个明显的热分解阶段，第一阶段中，BC热失重率最小为4%，COL最大为12%；第二阶段为主要热失重阶段，BC热失重率为61%，COL为70%；第三阶段各组分热失重速率均显著降低.
图11 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球TG曲线
图12 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球DTG曲线
由表3可知，最大失重值温度依次为BC(351 ℃)>BC/COL多孔微球(344 ℃)>CDABC(332 ℃)> DABC(327 ℃) >COL(309 ℃).上述实验结果表明，BC氧化后发生了热性质的变化，可能是因氧化后BC自身发生降解，小分子链段增加，导致了加热分解过程中所需要的热量减少，故热分解温度降低.BC较COL具有良好的热稳定性，BC与COL的复合能够改善COL热性能.
表3 TG和DTG曲线特征数据分析
2.2.4 扫描电子显微镜(SEM)
图13所示为BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球的SEM图谱.由图13(a)、(b)可知，BC由高密度纳米微纤维相互缠绕形成，具有清晰的三维网状结构；图13(c)、(d)所示BC氧化形成的DABC由于部分链段断裂，纤维发生卷曲，纤维排布变得混乱，但仍具有三维立体网状结构；图13(e)、(f)所示COL结构致密，无孔状分布，SEM显示其具有一定的纤维结构；图13(g)、( h)所示COL与DABC复合后，BC中的部分孔隙被COL所填充，所形成CDABC孔隙率较复合前降低，但仍呈现立体网状结构；图13(i)、(j)表明，采用反相悬浮再生法能够成功制备BC/COL多孔微球.微球形态较为圆整，其中有大量孔道分布，可为后续药物的负载提供空间.
(a)5 000倍BC (b)20 000倍BC
(c)5 000倍DABC (d) 20 000倍DABC
(e)5 000倍COL (f)10 000倍COL
(g)5 000倍CDABC (h) 10 000倍CDABC
(i) 1 000倍多孔微球 (j)3 000倍多孔微球图13 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球SEM图谱
3 结论
研究利用Malaprade反应原理，以高碘酸钠为氧化剂，BC进行氧化制备DABC.利用希夫碱反应使DABC中的-CHO-与COL中的-NH2反应，制备CDABC复合材料.采用反相悬浮再生法将CDABC制备成BC/COL多孔微球.
BC/COL多孔微球制备最优工艺为：乳化温度35 ℃，乳化时间5 h，十六烷∶(CDABC/IL)=10∶1，CDABC质量分数4%.在此工艺下制备BC/COL多孔微球载药率为254 mg/g.
利用FT-IR、XRD、TG及SEM对BC、DABC、CDABC、BC/COL多孔微球的化学基团、结晶度、热性能、及表面形貌进行分析，表明BC氧化、CDABC复合均能成功进行，且复合作用对材料的形貌、结晶度及热性能均有一定改善作用.采用反相悬浮再生法能够成功制备BC/COL多孔微球，可为后续药物的负载提供条件.
