硼酸盐生物玻璃和自体髂骨移植对新西兰兔桡骨大段骨缺损修复的对比研究*

关俊杰张解元王会黄文旵汪泱 谢宗平*

大段骨缺损的修复是骨科常见的难题。目前，异体和自体骨移植是大段骨缺损最常用的治疗方法[1]。自体骨移植效果最佳，但来源有限并且获取方法有创[2]。异体骨移植存在免疫排斥风险，失败率较高[3]。骨生物活性材料为大段骨缺损的治疗提供了新的选择。理想的骨生物活性材料应该具有良好的生物相容性和骨诱导活性，并且随着新骨的不断生成，材料逐渐降解，待材料完全降解时，新骨完全填充缺损处[4]。

研究发现，硼酸盐生物玻璃（borate glass,BG）具有良好的骨诱导性和生物相容性。BG在局部降解后可与骨组织存在密切的离子交换，并促进矿化作用。BG的降解性和机械性能与其组分密切相关，通过改变组分含量可以显著改变其降解速度和机械性能。由于BG具有以上生物学特性，使其成为一种具有广阔前景的骨填充材料[5]。本研究拟比较BG与自体髂骨移植对兔桡骨干缺损的修复作用，为临床骨缺损的修复提供更优的生物材料。

1 材料与方法

所有的动物实验均严格按照动物实验要求进行，且得到了我院伦理委员会的批准。

1.1 实验材料

实验动物：雄性清洁级新西兰兔38只，6～8周龄，体重2.5～3kg。由上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心提供。

试剂：钙黄绿素和茜素红购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 BG制备

BG制备参照以前描述的方法[6]，分子式为6Na2O-8K2O-8MgO-22CaO-54B2O3-2P2O5(mol%)。

1.2.2 动物手术

静脉注射戊巴比妥（30mg/kg）常规麻醉动物，剃毛后消毒铺巾。取左桡骨中段3cm长切口，逐层切开皮肤、浅筋膜、深筋膜和骨膜，分离暴露桡骨干。用摆锯制造桡骨干15 mm骨缺损，整个过程中生理盐水不断冲洗（见图1）。考虑髂骨取骨植骨术是有创操作，可能对动物的状态造成影响，所有动物都进行髂骨取骨术，大致步骤如下：取髂前上棘附近2cm长切口，逐层切开皮肤、浅筋膜、深筋膜和骨膜，咬骨钳咬取髂骨，骨剪剪成棒状。根据桡骨缺损处填充的材料不同随机将实验动物分组：空白组（n=8，缺损处无填充材料）；对照组（n=15，自体髂骨填充）；实验组（n=15，BG 填充）。可吸收线将材料或者自体髂骨固定缺损处，常规关闭伤口（见图2）。术后3天碘伏常规消毒切口，肌注青霉素抗生素预防感染，整个实验期间死亡2只（空白组1只，对照组1只），均为术后行X线检查麻醉时出现麻醉意外。

图1 建立兔桡骨干中段15 mm长骨缺损模型

图2 将BG植入骨缺损处，同时用可吸收线将材料固定于缺损处

为显示骨缺损处新骨生成和矿化，在6周和9周分别将荧光标记染料茜素红（30 mg/kg）和钙黄绿素(10 mg/kg)注射到动物腹腔中[7]。12周后将动物安乐死，标本于中性福尔马林溶液中固定48 h。

1.2.3 X线和Micro-CT检查

术后4、8和12周后行X线检查，评估新骨生成和材料降解情况。

将包含缺损处近端和远端各0.5 cm的标本固定于70%的乙醇溶液中。高分辨率 Micro-CT（Skyscan 1173,比利时）来分析骨缺损处新骨生成情况。按照25 m的分辨率扫描样本。将样本重建并进行3D分析，在同阈值条件下分析骨密度 (bone mineral density,BMD)和骨体积分数 (bone volume/tissue volume,BV/TV)[8]。

1.2.4 双色荧光标记

将样本置于梯度乙醇中脱水后包埋于聚甲基酸甲酯(PMMA)中。硬组织包埋成功后，将样本用硬组织切片机(Leica SP1600)以250 m的厚度进行纵切。将硬组织切片粘在透明塑料载玻片上，并打磨至最终厚度为60m。采用共聚焦荧光显微镜(Leica)来检测荧光染料在缺损处的沉积，将激发和发射光调节至543/580-670 nm和488/500-550 nm来观察茜素红和钙黄绿素的沉积情况。将硬组织切片进行 Van Gieson染色观察新骨生成情况。

2 结果

2.1 大体照片

大体照显示对照组和实验组12周后骨修复效果最好。缺损处的新生的骨形态与正常骨形态接近，BG基本降解完全。12周后空白组缺损处有少量的骨痂生成，缺损没有骨愈合迹象（见图3）。

图3 取材后大体照（A.空白组；B.对照组；C.实验组）

2.2 X线结果

空白组在3个时间点骨缺损都没有愈合迹象。对照组4周时有大量的骨痂生成，8周时骨痂不断重塑，12周时完全修复骨缺损。实验组中BG在4周时就逐步开始降解，8周时大部分已经降解，并有大量的骨痂生成，12周时缺损完全愈合并且支架降解完全，新生骨与正常骨的边界模糊，髓腔重新形成并再通（见图4）。

图4 术后4、8和12周各组X线片

2.3 Micro-CT重建与分析

Micro-CT重建结果显示12周后对照组和实验组新骨明显多于空白组。进一步的形态学结果分析显示对照组和实验组局部BMDs和BV/TV明显优于空白组，对照组和实验组之间没有明显的统计学差异（见图5）。

图5 术后12周桡骨缺损处Micro-CT（A.空白组；B.对照组；C.实验组）和成骨分析（*P＜0.05和空白组相比，**P＜0.05和空白组相比）

2.4 矿盐沉积和新骨生成

亲骨荧光染料随着新骨的矿化沉积在新骨生成区域，可直观反映新骨生成情况。亲骨荧光染色显示在术后6周和9周茜素红和钙黄绿素沉积在对照组和实验组明显多于空白组（见图6，彩图见插页）。该结果显示对照组和实验组新骨生成和矿化速度明显快于空白组。

图6 亲骨荧光标记显示各组新骨生成和矿盐沉积

2.5 Van Gieson染色

为进一步显示缺损处新骨生成情况，行VanGieson（VG）染色。VG染色结果显示空白组有大量的纤维组织（箭头所示），对照组和实验组有大量的新骨生成（*所示），并且有大量正在矿化的软骨组织（#所示），见图7，彩图见插页。VG染色结果直接证实对照组和实验组修复效果明显优于空白组。

图7 VG硬组织染色显示各组新骨生成情况（箭头示胶原纤维，*示骨组织，#示软骨组织）

3 讨论

生物活性材料的出现为骨缺损的治疗提供了新的选择。BG作为一种生物活性玻璃，在骨缺损治疗领域具有广阔的应用前景[9]。目前尚未将BG的骨修复性能与自体骨移植这一金标准进行比较的报道。基于早期课题组工作，设计了将BG的骨修复性能与自体骨移植直接进行比较的实验研究。本实验证实BG能完全修复大段骨缺损，X线、Micro-CT、亲骨荧光染色和组织学染色都显示实验组新生骨明显多于空白组，与自体髂骨移植效果接近。

理想的骨修复材料不但具有优良骨诱导性能，并且还要有合适降解速度。通过X线显示BG的降级速度与新生骨的生成速度相匹配。随着时间的延长，BG不断降解，同时新骨不断生成。最终BG完全降解新骨完全填充缺损处，达到完全愈合。

研究证实，硼离子能激活多条成骨相关的通路，BG良好的骨诱导性与硼元素密切相关[10]。本课题组的早期研究也证实了BG通过激活BMSCs成骨相关的BMP/Smad信号通路促进骨再生[11]。随着植入的 BG在缺损处的降解，硼离子在缺损处发挥成骨效应，促进新骨生成。必须要指出的是，超过一定浓度的硼离子具有毒性。以前的研究报道兔对于硼元素的安全剂量＜100 mg/Kg。我们的血样分析也显示硼元素在血中的浓度远低于中毒剂量。组织学染色也没有发现局部硼中毒现象。本研究证实BG不但能发挥良好的成骨诱导性能，还具有良好的生物相容性，在修复效果上达到了自体骨移植这一金标准。

本实验提示BG具有强大的骨诱导性能。因此，有必要进一步通过大动物实验验证其骨修复性能，为BG的临床转化奠定坚实的基础。