碱水法提取草珊瑚中酚酸类成分的工艺研究

， ，，·，

(1.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州516007；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐830002)

草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]，又叫肿节风、九节茶等，具清热凉血、镇痛消炎、活血通络、祛风消斑等作用，含黄酮、有机酸、酚类、鞣质、香豆素和内酯等成分[1]，其中有机酸成分为主要活性成分，如富马酸、琥珀酸、原儿茶酸、棕榈酸、硬脂酸、绿原酸、迷迭香酸[2]，已有草珊瑚含片、肿节风注射液等多种剂型上市。本文根据酸碱作用原理，以碱水为溶剂，利用酚酸类成分与碱形成盐，易溶于水，采用超声波辅助提取，通过酸化提取液，使酚酸类成分形成沉淀析出，提高酚酸类成分提取率和纯度。

1 仪器与材料

1.1 材料

草珊瑚药材，2015年10月购于广西北京同仁堂药店，经笔者鉴定为金粟兰科植物草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]的干燥全草，粉碎成粗粉，备用。

1.2 仪器

三源超声波清洗器(东莞三源超声波设备有限公司)；UV-2550岛津-紫外可见分光光度计；pH计(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 试剂

富马酸(北京百灵威科技有限公司)，分析纯试剂。其余试剂均为分析纯试剂。

2 实验方法与结果

2.1 标准曲线的制备[3]

精密称取10 mg 富马酸，加60%乙醇使溶解，定容到25 mL量瓶中，摇匀，作为对照品溶液。精密称取草珊瑚粉末0.500 g，置具塞锥形瓶中，加60%乙醇20 mL，密塞，混匀，80 ℃ 500 W超声30 min，滤过，取续滤液1 mL 置10 mL 量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。

分别取对照品溶液和样品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，配制成不同浓度的对照品溶液，依次加乙醇2 mL、0.08 mol·L-1盐酸羟胺溶液1 mL、0.04 mol·L-1DCC (N,N’-二环己基碳二亚胺)溶液1 mL，摇匀，60 ℃水浴15 min，加0.04 mol·L-1高氯酸铁溶液1 mL，加乙醇至刻度，摇匀，在200～700 nm范围进行扫描。结果表明，富马酸与草珊瑚吸收光谱图相似，在520 nm处有最大吸收波长。

分别取对照品溶液1～6 mL置10 mL量瓶中，加乙醇至刻度，于520 nm处吸光度，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程式y= 0.004 5x+0.009 9(r= 0.999 2)，结果表明，富马酸在40～240 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 提取方法的选择

取0.5 g草珊瑚粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10倍量水，密塞，按表1方法提取，滤过，滤液置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，在60 min内按2.1方法测定吸光度。根据吸光度与物质浓度呈线性关系，吸光度越大，浓度越高，提取效果越好，结果表明，超声提取法的吸光度最大，故选择为本文的提取方法。

表1 提取方法对吸光度的影响

2.3 单因素实验

取0.5 g草珊瑚粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，加碱水10 mL，超声提取，滤过，滤液用稀HCl调pH，静置，滤过，用水溶解沉淀，定容于10 mL量瓶中，测定吸光度，依次考察碱种类、碱水浓度、碱水pH值、沉淀pH值、提取时间、提取温度、料液比对草珊瑚中酚酸类成分提取效果的影响。结果表明，碱种类以NaOH最好，碱水浓度以1.0 mol·L-1最好，碱水pH以10最好，沉淀pH值以4最好，提取时间越长越好，提取温度60℃以最好，料液比越高越好，如图1～7。

图1 碱种类-吸光度变化

图2 碱水浓度-吸光度变化

图3 碱水pH-吸光度变化

图4 沉淀pH值-吸光度变化

图5 提取时间-吸光度变化

图6 提取温度-吸光度变化

图7 料液比-吸光度变化

2.4 正交试验

根据单因素的实验结果，不考虑各因素之间的交互作用，选取碱水pH值、提取温度、提取时间、料液比4个因素3水平，进行 L9(34)正交试验，实验步骤同单因素实验，用SPSS 19.0进行数据处理与分析。由极差分析可知，影响提取率的因素排列顺序为B>D>A>C，即碱水pH值>提取温度>提取时间>料液比。方差分析表明，碱水pH值和提取温度对提取率的影响有显著性(P<0.05)，而提取时间和提取温度对提取率的影响无显著性(P>0.05)。综合考虑能源消耗、工艺成本、原料价格、提取效果等方面因素，确定最佳提取条件为A1B2C3D2，即提取时间为30 min，碱水pH值为10，料液比为1∶10，提取温度为60 ℃，结果见表2和表3。

表2 正交试验直观分析

表3 正交试验方差分析

2.5 方法学验证

取对照品溶液，连续测定吸光度5次，考察精密度，结果为A=0.865±0.079，RSD=0.12%。取对照品溶液于0～120 min测定吸光度5次，考察稳定性试验，结果为A=0.866±0.083，RSD=0.07%。取0.5 g草珊瑚粉末，共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，按优选工艺提取，测定吸光度，考察重复性，结果为A=0.861±0. 096，RSD=0.95%，表明本方法在120 min内精密度、稳定性和重复性良好。

2.6 碱水提取法与水提法的比较

取0.5 g草珊瑚粉末，精密称定，分别以pH=10的碱水和水为溶剂，按优选工艺提取，测定吸光度，计算样品中酚酸类成分的含量。碱水提取法样品中酚酸类成分含量0.393±0.025，RSD=0.86%，n=3；水提取法样品中酚酸类成分含量为0.360±0.026，RSD=1.61%，n=3；用Excel软件进行数据处理与分析，按α=0.025水准，当t≥3.495时，接受原假设，两种提取方法所得酚酸类成分含量有显著性差异，即碱水提取法优于水提法，见表4。

表4 两种方法提取效果的独立样本检验分析

3 讨 论

超声波具有剪切作用和冲击波能，使植物细胞璧破碎或变形，细胞内化学成分容易渗出，碱能与酚酸类成分结合生成盐，提高酚酸类成分从细胞内渗出的速度和渗出量，从而提高提取效率，通过酸化作用，使酚酸类成分游离出来，去除大部分的杂质，所得产品纯度更高。本文采用碱水-超声波法提取草珊瑚中酚酸类成分，工艺稳定，提取率提高，杂质减少，操作简单、速度快。

按文献[3]的显色方法，依次加入0.106 87 mol·L-1的高氯酸羟胺溶液1.10 mL、0.16 mol·L-1的DCC溶液0.15 mL，震荡摇匀，室温放置15 min，加0.102 mol·L-1酸性高氯酸铁溶液，显色效果不佳，并且实验室水平制备高氯酸羟胺具有一定的危险性，因此，本文参照文献[4-5]，并作适当调整，使用0.08 mol·L-1的盐酸羟胺溶液与0.04 mol·L-1的DCC溶液各1 mL，充分混合，60 ℃水浴15 min，加0.04 mol·L-1高氯酸铁溶液1 mL，显色效果良好，富马酸浓度与吸光度线性关系良好，本方法精密度、稳定性、重复性均达到要求。