水貂阿留申病毒感染过程中主要分子蛋白作用机理研究进展

栾美慧，李健明，时 坤，刘 艺，徐 宁，郜艳雪，宫庆龙，孙志博，冷 雪*，杜 锐

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；3.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春130118)

水貂阿留申病(Aleutian mink disease，AMD)是由AMD 病毒(AMDV)感染水貂引起的自身免疫系统功能紊乱，并引发自身免疫的慢性、传染性疾病，在全球范围的水貂养殖国家造成了重大的经济损失[1-2]。由于其特殊的致病机制和抗体依赖性增强作用(ADE)[3-4]，尚无预防该病的商业疫苗。目前主要通过检疫淘汰病貂来净化貂厂，但该方法无法从根本上杜绝该病的发生发展。因此国内外对AMDV 致病机制进行了大量研究，结果表明AMDV 中参与ADE 的结构蛋白、负责调控病毒复制的非结构蛋白及宿主的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)在致病机制中具有重要作用。本文对AMDV 感染过程中各主要分子蛋白的相关调控进行阐述，以期为AMDV 的致病机理以及进一步研究和防治AMD 奠定理论基础。

1 AMDV概述

AMDV 属于细小病毒科(Parvoviridae)阿留申细小病毒属(Amdoparvovirus)，该病毒粒子直径约24 nm～26 nm，无囊膜，结构结实紧密，呈正二十面体对称，对外界环境抵抗力强，耐热，并耐受氯仿等有机溶剂。目前，已知的对AMDV 易感的动物种类已经从水貂扩大为水貂、灰狐、臭鼬、貉等[5-9]，并且有相关研究人员在貂场养殖工人体内检测到了该病毒[10]。

新发现的貉蓝狐阿留申病毒(RFAV)、火狐阿留申病毒(RFFAV)和灰狐阿留申病毒(GFAMDV)在2014年被国际病毒分类委员会纳入阿留申病毒属[11]。AMDV 对水貂的感染因水貂的年龄不同，其病理表现也不同。对成年水貂，AMDV 由Fc 受体介导感染其巨噬细胞。在幼年水貂中，病毒感染其肺泡II 型细胞并引起该细胞死亡。AMDV 可以通过血液、唾液、粪便和尿液的直接或间接接触感染，还可以从感染的雌性水貂垂直传播到幼年水貂。病毒粒子在环境中具有高度稳定性，这种稳定性使得病毒难以从受污染物体的表面清除，并使得病毒在野外、养殖场内和养殖场之间传播。

AMDV 为线性单股负链 DNA 病毒，基因组约为4 800 bp，包含发夹结构及两个开放阅读框，分别编码结构 蛋 白 VP1、 VP2 及 非 结 构 蛋 白 NS1、 NS2、 NS3。AMDV 与其它细小病毒相似，依赖S 期复制，当宿主聚合酶结合3' 末端发夹并且基因组被转化为双链DNA 时，复制开始。尽管尚未明确AMDV 的复制机制，但是其中几种复制中间体经鉴定与细小病毒滚动发夹复制(RHR)模型一致。相关研究证明，AMDV 结构和非结构蛋白在其感染致病过程中存在重要调控作用，且宿主Caspases 的活性和AMDV 各主要蛋白协同促进了疾病的发展进程[12]。

2 结构蛋白VP1和VP2

2.1 VP1 和VP2 的切割和活化研究表明 VP1 和 VP2在AMDV 复制中占有重要地位。AMDV 在猫肾细胞(Cr-FK)中参与复制的主要mRNA 为R2 mRNA。R2 mRNA 主

要编码病毒衣壳蛋白VP1 和VP2，在病毒核衣壳中VP1和 VP2 的比例为 1∶9，在 VP1 中不存在磷脂酶 A2(PLA2)结构域，在VP2 中含有主要的抗原决定簇[13]。Cheng 等人分别构建了表达 VP1、VP2 及VP1-VP2 融合蛋白的3 种质粒，并转染CrFK 细胞，结果显示 AMDV 的衣壳蛋白VP1 和VP2 在病毒感染期间被Caspase 特异性切割成26 ku的小分子蛋白。为了进一步验证特异性切割衣壳蛋白的Caspase 种类，他们继续构建了表达GST-VP2 融合蛋白的重组质粒，将表达并纯化的融合蛋白与活化后的Casepase 1～Casepase10 分别孵育。结果显示，仅有Caspase 7 能够特异性切割GST-VP2，并在26 ku 处产生条带。由此表明，Caspase 7 是在宿主体内或在病毒感染期间裂解VP2的效应 Caspase[12]。

2.2 AMDV 的结构蛋白 VP2 与 ADE 效应AMDV 在感染过程中具有ADE 效应，其也是AMDV 疫苗免疫失败及导致宿主免疫功能紊乱的主要原因。有研究表明，AMDV能够感染巨噬细胞，但由于很难获得足够数量的原代水貂巨噬细胞，所以Dworak 使用人类巨噬细胞系K562 检测了AMDV 与巨噬细胞之间的相互作用，以阐明AMDV 基因表达和巨噬细胞功能在其感染过程中发生的变化[14]。研究显示，在用针对鼠 Fc(γ)RIIA 单克隆抗体(IV.3)染色后，通过流式细胞术分选AMDV 感染的K562 细胞，结果只有表达AMDV 基因的细胞呈IV.3 阳性，AMDV 对经IV.3 孵育的K562 细胞的感染率可减少90 %，由此表明在 K562 细胞中 AMDV 的 ADE 是由 Fc(γ)RIIA 介导的[14]。另外，Cheng 等人证明，AMDV 衣壳蛋白 VP2 激活了Caspase 信号途径，产生的26 ku 蛋白介导了ADE 及免疫复合物的形成[12]。因此，AMDV 的 ADE 是其衣壳蛋白VP2 与Fc 受体蛋白Fc(γ)RIIA 结合介导的。目前，ADE的机制尚不明确，但上述研究证明了AMDV 衣壳蛋白VP2 在其感染机制中的重要作用。

3 非结构蛋白NS1与病毒复制

非结构蛋白NS1 在病毒的转录和复制过程中发挥重要作用。细小病毒感染细胞后可诱导细胞凋亡及坏死，并且这一凋亡作用与病毒的非结构蛋白NS1 有关。细小病毒NS1 蛋白在病毒复制、病毒启动子反式激活和细胞病变效应的诱导中起关键作用[15]。Aasted 等人以成年健康水貂为实验动物，与未接种NS1 的水貂相比，接种NS1 蛋白的水貂感染AMDV 后的临床表现更温和，表明NS1 蛋白亚单位疫苗对水貂有一定的保护作用[15]。2005年，Castelruiz 等人构建了表达NS1 蛋白的重组质粒。然后，将18 只雌性水貂分成3 组：对照组、DNA 疫苗单次免疫组和用DNA 疫苗首免，重组 NS1 蛋白加强免疫组(DNA+NS1 蛋白)。免疫后，在32 周的观察期中两个免疫组在前23 周诱导了高水平抗体。另外，与其它两组相比，“DNA +NS1 蛋白”组水貂显示出更高水平的CD8+T 淋巴细胞反应。研究表明，两个免疫组水貂均表现出较轻微的临床症状，该实验进一步证明了NS1 蛋白接种水貂能够对其起到一定的保护作用[16]。因此，NS1 蛋白在AMDV致病机理中发挥重要作用。

AMDV 非结构蛋白NS1 的功能与其它细小病毒类似，NS1 是AMDV 最大的多功能蛋白。AMDV 在宿主体内增殖过程中表达NS1 蛋白，并且通过调控晚期蛋白而在病毒复制中起重要作用[16]。AMDV 的高效复制需要激活特异性Caspase 的活性，包括Caspase 3 和 Caspase 7。为研究病毒在复制过程中，NS1 蛋白的裂解与Caspase 的相关性，同时，确定裂解后NS1 蛋白在细胞中的定位，Best等人将感染AMDV 的CrFK 细胞裂解物分别与纯化的Caspase 3 和Caspase 7 作用，与对照组相比，Caspase 作用的细胞裂解物产生两种新的蛋白片段，分别为39 ku 和33 ku 蛋白分子，同时均检测出一个大小约为27 ku 的片段。另外，通过添加Caspase 3 抑制剂，可以抑制这些片段的产生[17]。因此证明Caspase 能够裂解AMDV 蛋白。为了确定Caspase 是否直接裂解AMDV 非结构蛋白NS1，将重组表达纯化的NS1 蛋白与纯化的Caspase 同时孵育，结果显示，纯化的NS1 蛋白在两个位点被Caspase 裂解，并产生3 个片段，大小约为46 ku、39 ku 和33 ku，从而确定了Caspase 可以直接裂解NS1。为研究NS1 的裂解对其细胞核定位的影响，从而确定NS1 裂解产物在细胞中的定位，Best 等人分别提取AMDV 感染细胞的细胞核和细胞质蛋白进行检测，结果显示，在Caspase 切割后，大多数NS1 裂解蛋白存在于细胞核中。因此，AMDV 的NS1蛋白切割对AMDV 复制至关重要[17]。

4 非结构蛋白NS2和NS3的作用

AMDV 非结构蛋白家族包括大分子非结构蛋白NS1及小分子非结构蛋白 NS2 和NS3[18]。据报道，为确定NS2 及NS3 蛋白在AMDV 感染期间的表达水平及该两种蛋白的功能调控，Huang 等人利用AMDV G 株感染CrFK细胞，使用能够同时识别NS1、NS2 和NS3 蛋白的兔多克隆抗体检测AMDV 感染6 d 内NS 蛋白的表达水平。结果显示，在感染期间NS3 蛋白表达水平极低，NS2 蛋白及NS1 蛋白表达水平类似。为确定NS2 蛋白和NS3 蛋白的功能，Huang 等人将纯化后的GST-NS2 融合蛋白及GST-NS3 融合蛋白分别免疫大鼠，并利用针对NS2、NS3的单克隆抗体检测NS2 及NS3 的细胞定位。结果显示，在AMDV 感染期间，NS2、NS3 蛋白均在细胞核中表达。并将NS1 蛋白、NS2 蛋白及AMDV DNA 复制中心进行细胞共定位试验，结果显示，NS2 蛋白可与NS1 蛋白在AMDV DNA 复制中心共定位。将NS1 蛋白、NS3 蛋白及AMDV DNA 复制中心进行细胞共定位试验，结果显示，NS3 不与NS1 共定位，且其不在病毒DNA 的复制中心[19]。

为了进一步探究NS2 和NS3 在AMDV 复制中的作用，Huang 等人利用AMDV 感染性克隆分别构建了敲除NS1、NS2、NS3 蛋白的重组病毒，将其转染到细胞中，通过免疫荧光试验分别观察三组重组病毒的抗体荧光强度。结果显示3 组重组病毒的荧光强度均未发生改变。表明转染后各重组病毒的复制水平没有增强。同时，测定了子二代病毒的病毒滴度，结果显示，转染后，3 种重组病毒均未产生复制形式的病毒DNA，不会产生感染性病毒，而野生型对照组(PIAMDV)产生了子代病毒，且病毒滴度为2.0×105cfu/mL[19]。上述结果表明，NS2 和NS3 蛋白在AMDV 感染CrFK 细胞过程中的表达，与AMDV 的DNA复制密不可分。

5 Caspase促进病毒复制

AMDV 是DNA 病毒，其不仅诱导细胞凋亡，而且利用Caspase 活性来促进病毒的复制[20]。AMDV 感染CrFK细胞可以诱导细胞周期停滞和凋亡。细胞凋亡是细胞一种自我调节的生理过程，涉及正常的细胞转换，其特征是细胞不同的形态变化和其DNA 降解[21]。其中Caspases 是诱导细胞凋亡的核心蛋白，其活性中心含有半胱氨酸[22]，能够特异性水解天冬氨酸。当Caspase 活化后能够诱导细胞凋亡，而Caspase 的活化涉及复杂的蛋白水解级联反应。目前，已知的Caspases 家族共有13 个成员(Caspase 1～Caspase 13)，Caspase 8、Caspase 9、Caspase 10 为凋亡启动子，Caspase 3、Caspase 6、Caspase 7 为凋亡效应分子。Best 等人通过TUNEL 染色、膜联蛋白 -V 染色等试验，证明AMDV 感染CrFK 后发生了细胞凋亡现象。随后使用Caspase 3 及Caspase 广谱抑制剂分别预处理CrFK 细胞后，感染AMDV 并观察细胞凋亡状态，结果表明，Caspase1、Caspase 6 和Caspase 8 的抑制剂并不能抑制细胞凋亡。因此，AMDV 诱导的细胞凋亡，依赖于特定Caspase的激活，使用特异性Caspase 抑制剂，才可以抑制细胞凋亡。另外，与未添加抑制剂的对照组相比，Caspase 抑制剂抑制了细胞的凋亡，并使实验组的AMDV 复制减少了100 倍[23]。水貂肠炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)属于细小病毒科，利用其感染CrFK 细胞，也可以诱导细胞凋亡，但感染性MEV 的复制不受Caspase 抑制剂的影响。因此，在细小病毒中，AMDV 对Caspase 活性的依赖性复制具有唯一性。

6 小结与展望

综上所述，AMDV 的结构蛋白VP1 和VP2 在感染期间被Caspases 特异性切割成26 ku 小分子蛋白，并且证实了 AMDV 26 ku 的切割蛋白与 Fc(γ)RIIA 结合介导了ADE 效应，表明结构蛋白在AMDV 的ADE 和致病机理中存在重要作用。非结构蛋白NS1 必须经过Caspases 的特异性切割，才能起始病毒复制，表明非结构蛋白NS1在病毒复制中有关键作用。对小分子非结构蛋白NS2 和NS3 在AMDV 感染的CrFK 细胞过程中的表达水平的检测，证实该两个蛋白与AMDV 的DNA 复制密不可分。因此对于AMDV 的增殖和感染不仅依赖于宿主特异性Caspase 的激活和调控，而且和 AMDV 的主要蛋白 VP1、VP2、NS1、NS2 及 NS3 相关。

迄今为止，尚无防控AMD 的商品化疫苗，且通过对AMDV 基础性研究，使人们意识到了AMDV 在感染过程中各分子蛋白的功能和调控机制在病毒复制及感染中具有关键意义。近年来国内外加深了对AMDV 感染过程中各分子蛋白的分析和研究，明确了AMDV 无论在水貂体内或者体外的感染复制，均具有一个相当复杂的调控过程。因此要从病毒的蛋白表达、衣壳装配和Caspases 活化之间的相互关系做更深入的研究，为避免ADE 和成功研制出有效的AMD 疫苗打下坚实的基础。