甲胎蛋白基因沉默对肝癌细胞迁移黏附能力的影响及其机制

王莉，贺涛，冯世杰，万百顺，王效谦，张珉，张玲，韩风

(郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院，郑州450008)

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)可影响细胞的分化、增殖及肿瘤发生，目前已被公认为是一种有助于诊断和判断原发性肝癌预后的肿瘤标志物，70%的肝癌患者血清高表达AFP[1，2]。肝癌细胞系EGHC-9901是近些年构建的细胞系，可形成完整毛细胆管且有明显微绒毛，能持续高分泌AFP，细胞变异较小，是体外研究AFP功能的良好生物学模型[3]。我们在前期研究中利用能持续高分泌AFP的肝癌细胞系EGHC-9901建立了稳定表达siRNA的细胞模型，探讨了沉默AFP基因对其生长凋亡的影响及相关机制[4，5]。2017年4月1日～2018年5月30日，我们观察了AFP基因沉默对肝癌细胞迁移黏附能力的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 肝癌细胞系EGHC-9901(前期实验[4，5]中，我们采用脂质体法已获得稳定转染的EGHC-9901细胞，Western blotting法及RT-PCR法检测AFP蛋白及基因确证转染成功)由山东大学提供。G418、RT-PCR试剂盒、TRIzol、DMEM培养液干粉及胎牛血清购自上海英骏生物技术有限公司，AFP小鼠抗人单克隆抗体及E-钙黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附转移相关分子抗体购自BD公司(英国)。核酸及蛋白电泳仪、蛋白转印仪购自BIO-RAD公司(美国)，台式冷冻离心机购自Sigma公司(美国)，PE2400型 PCR仪购自PE公司(美国)，凝胶图像分析系统购自UVP公司(美国)，CO2培养箱购自NACPO公司(美国)。

1.2 细胞培养、分组及AFP基因沉默 pSilencer3.0-H1-AFP重组质粒(用于沉默AFP基因)的构建参照文献[6]，DNA琼脂糖凝胶电泳及Ml3的通用引物测序表明，该质粒大小与阳性质控质粒相同，插入片段的序列与已合成的寡核苷酸的序列完全一致，未发现有插入、缺失及突变等异常。EGHC-9901细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(添加相应的青霉素-链霉素等)中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。取生长良好的对数生长期EGHC-9901细胞进行试验。将EGHC-9901细胞分为3组：实验组转染pSilencer3.0-H1-AFP质粒、载体对照组转染空载体、空白对照组未做任何处理。

1.3 各组细胞迁移能力检测 采用Transwell 迁移实验。Transwell小室置入24孔培养板,形成上下两个小室。各组细胞经胰蛋白酶消化后重悬于无血清0.5% BSA DMEM培养基，配制浓度为1×106/mL的细胞悬液,取100 μL细胞悬液加入上层小室,下层小室加胎牛血清培养基，培养24 h后,以甲醇固定Transwell膜，结晶紫染色。洗脱膜表面的细胞并用中性树胶封闭于玻片中，镜下观察穿膜细胞并拍照，随机选取5～8个视野计数穿膜细胞，取平均值。

1.4 各组细胞同质黏附能力检测 采用细胞聚集实验。各组细胞经HCMF洗涤及胰蛋白酶消化后，调节细胞浓度为2×105/mL，按每孔500 μL细胞悬液加入到BSA包被好的24孔培养板，将培养板置于空气振荡器上，80 rpm分别振摇20 min、40 min、60 min，显微镜下观察细胞形态，并统计聚集细胞数及单个细胞数。通过计算细胞聚集指数(aggregation index，AI)来衡量细胞同质黏附能力。AI=(N0-Nt)/N0，其中N0为细胞聚集实验开始前总细胞数(包括单个细胞与聚集细胞)，Nt为特定时间后总细胞数(包括单个细胞与聚集细胞)。

1.5 各组细胞异质黏附能力检测 采用层黏连蛋白黏附实验。各组细胞经0.1%胶原酶溶液消化，制备细胞悬液，加入到层黏连蛋白包被的96孔培养板，每孔加l×106个细胞，设PBS孔作空白对照组，每组设5个复孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别于30 min、60 min、90 min时提取细胞，CCK-8试剂盒避光染色2 h，490 nm处检测各组OD值，以OD值反映细胞异质黏附能力。

1.6 各组细胞黏附分子E-钙黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-连环素、β-连环素、CD15表达检测 采用Western blotting法。各组细胞采用改良lorry法进行蛋白定量，绘制标准蛋白浓度曲线，依此作为回归方程计算待测样品浓度。经β-巯基乙醇加热处理后上样， 5%浓缩胶电泳40～60 min。在PVDF膜进行电转移，5%脱脂奶粉封闭，敷封闭液稀释的细胞黏附蛋白AFP小鼠抗人一抗，4 ℃过夜，PBST洗膜，敷封闭液稀释HRP标记的二抗，室温静置4 h，增强化学发光试剂盒(ECL)检测黏附蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，结果以受检蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2 结果

2.1 各组细胞迁移能力比较 实验组、载体对照组、空白对照组每个镜下穿膜细胞数分别为(132±16)个、(335±21)个、(371±32)个，实验组与载体对照组、空白对照组相比，P<0.05。

2.2 各组细胞同质黏附能力比较 实验组镜下可见大量的细胞团块状组织，而载体对照组及空白对照组可见大量散在的细胞及小的细胞团块。

振摇时间20 min时，实验组、载体对照组、空白对照组AI分别为0.263±0.010、0.216±0.013、0.220±0.009，组间相比，P均>0.05。振摇时间40 min时，实验组、载体对照组、空白对照组AI分别为0.530±0.020、0.223±0.017、0.240±0.012，实验组与载体对照组、空白对照组相比，P均<0.05。振摇时间60 min时，实验组、载体对照组、空白对照组AI分别为0.632±0.031、0.322±0.021、0.376±0.019，实验组与载体对照组、空白对照组相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞异质黏附能力比较 培养30 min时，实验组、载体对照组、空白对照组OD值分别为0.225±0.014、0.223±0.018、0.267±0.020，组间相比，P均>0.05。培养60 min时，实验组、载体对照组、空白对照组OD值分别为0.157±0.008、0.347±0.026、0.363±0.039，实验组与载体对照组、空白对照组相比，P均<0.05。培养90 min时，实验组、载体对照组、空白对照组OD值分别为0.139±0.010、0.476±0.023、0.503±0.045，实验组与载体对照组、空白对照组相比，P均<0.05。

2.4 各组细胞黏附分子E-钙黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-连环素、β-连环素、CD15表达比较 见表1。

表1 各组细胞黏附分子E-钙黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-连环素、β-连环素、CD15表达比较

注：与空白对照组相比，﹡P<0.05；与载体对照组相比，﹟P<0.05。

3 讨论

肿瘤细胞的迁移是一个多步骤、多阶段的复杂过程， 其中肿瘤细胞与细胞外基质和基底膜黏附、肿瘤细胞侵袭细胞外基质和血管基膜、肿瘤细胞向远处迁移是转移过程中的三个重要步骤，包括蛋白降解酶、肿瘤细胞的侵袭迁移以及肿瘤细胞的黏附[7]。细胞合适的迁移黏附是机体维持正常的生命活动与防御机制所必须的，但迁移黏附能力的异常改变是导致肿瘤侵袭转移的重要因素[8]。肿瘤细胞自身黏附能力，即同质黏附能力的减弱将会导致肿瘤的播散；肿瘤细胞与基质等黏附能力，即异质黏附能力的增强则会导致肿瘤的转移[9]。在本实验中，我们检测了转染前后细胞迁移能力、同质黏附能力以及异质黏附能力的变化，结果发现，AFP基因沉默可抑制肝癌细胞迁移，促进肝癌的同质黏附能力，抑制细胞异质黏附能力。

黏附能力的改变主要由细胞黏附分子介导[10]。细胞黏附分子本质上是细胞膜上的一类跨膜糖蛋白，能够介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞及实质器官组织细胞或其它肿瘤细胞之间的相互作用，包括免疫球蛋白超家族、 整合素家族、 选择素家族和血管附着素家族黏附分子以及钙黏素家族等。与原发性肝癌的侵袭转移相关的主要黏附分子包括E-钙黏蛋白、CD44V6、整合素β1、整合素α5、α-连环素、β-连环素、CD15等[11]。E-钙黏蛋白与肝癌的分化程度、侵袭转移能力以及病情发展密切相关[12];E-钙黏蛋白的低表达或缺失往往提示肝癌侵袭能力强，分化程度低，且容易经淋巴结或血液转移[13]。CD44V6是一种细胞表面黏附分子，主要参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质的特异性黏连，参与细胞伪足的形成，引起细胞的形态和游动性改变，直接参与肿瘤的侵袭和转移；CD44V6在正常肝脏组织或良性肝脏肿瘤往往低表达，而在肝脏恶性肿瘤中则往往高表达，并且表达的高低与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关[14]。整合素家族是一组介导细胞与细胞以及细胞与基质之间的跨膜糖蛋白，参与跨膜信息系统，影响细胞形态、基因表达与调控以及肿瘤侵袭转移等[15]。β-连环素是一种重要的信号转导分子和细胞间黏附分子,是Wnt信号转导通路的关键调控点，并是构成黏附连接的E-cd/cat复合体的胞内重要成分,并通过与多种蛋白的结合参与肿瘤的发生发展、增殖分化、侵袭转移等生物学过程[16]。CD15 是细胞表面糖蛋白或糖脂含有的外链岩藻糖化的乙酰乳糖胺糖链，作为细胞黏附分子成员，可通过结合含有选凝素的血小板、粒细胞及内皮细胞促进癌细胞转移，与肿瘤的发生发展密切相关[17]。本研究检测了转染前后E-钙黏蛋白、CD44V6、CD15等黏附转移相关分子表达水平变化，结果发现，整合素β1蛋白表达量升高、CD15蛋白表达量降低，提示AFP可能通过调节黏附蛋白整合素β1、CD15的表达调控肝癌细胞的迁移黏附能力。

综上，AFP基因沉默表达可抑制肝癌细胞迁移，促进肝癌的同质黏附能力，抑制细胞异质黏附能力。AFP可能通过调节黏附分子整合素β1、CD15的表达调控肝癌细胞的迁移黏附能力。