miR-23b转染宫颈癌干细胞顺铂化疗敏感性变化及其机制

凌芳，沈慧玲

(1 江苏大学附属医院，江苏镇江212001；2 江苏大学附属人民医院)

宫颈癌是威胁女性生命健康的重大疾病，据统计，全球每年约有53万新发病例[1]。近年来，宫颈癌在手术、放化疗等方面取得了较好的临床疗效，但仍有超过半数的宫颈癌患者处于疾病晚期，放化疗耐药是制约临床疗效、导致宫颈癌晚期患者不良预后的重要原因。肿瘤组织中存在能够自我更新并分化为肿瘤细胞的肿瘤干细胞,与其他肿瘤干细胞类似，宫颈癌干细胞对放化疗具有原发耐药性，是导致宫颈癌化疗耐药、术后复发的主要原因[2]。乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)是新近发现的肿瘤干细胞标志分子，与多种实体肿瘤的发生发展密切相关[3]。越来越多的证据表明，微小RNA(microRNAs)异常表达在疾病或肿瘤的发病过程中发挥重要作用，如microRNA-187(miR-187)通过抑制FGF9基因表达进而抑制宫颈癌细胞增殖[4]，miR-494参与调节SOCS6基因表达，调控宫颈癌细胞增殖过程[5]。有报道[6]称，在宫颈癌中，miR-23b具有抑癌基因功能，而关于miR-23b在宫颈癌干细胞中的表达及作用机制，鲜见文献报道。2015年7月～2018年2月，本研究观察了miR-23b转染对宫颈癌干细胞顺铂(CDDP)化疗敏感性的影响，并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 miR-23b、细胞及试剂 miR-23b模拟物(miR-23b mimics)、miR-23b阴性对照物(miR-23b NC)由上海吉玛制药技术有限公司合成。人宫颈癌细胞系CaSki和人胚胎肾细胞系HEK-293T均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMSO试剂均购于美国Invitrogen生命技术有限公司，CD133抗体(ab19898)购于美国Abcam公司，RNA提取试剂盒、real-time PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，定量引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，顺铂(CDDP，国药准字H37021358)购于山东齐鲁制药有限公司，CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，Lipofectamine®3000脂质体试剂盒购自美国Invitrogen公司，RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。兔抗人ALDH1A1单抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体购于美国Abcam公司，HRP标记二抗、ECL发光液购自北京诺特莱斯生物科技有限公司。内参质粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR wt(野生型)荧光素酶质粒、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR mut(突变型)荧光素酶质粒和pmirGLO空载体质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成，双荧光素酶检测试剂盒购于北京威格拉斯生物技术有限公司。

1.2 细胞培养和宫颈癌干细胞(CDl33+CaSki细胞)的分选[7]人宫颈癌CaSki细胞和HEK-293T细胞均培养于DMEM培养基(含10% 胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，采用0.25%胰蛋白酶消化传代培养，DMSO试剂进行细胞冻存，遵循缓冻速融原则，维持细胞状态良好。取处于对数生长期的CaSki细胞，胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液调整细胞浓度为1×106/mL，加入CD133抗体，避光孵育20 min，流式细胞仪进行分选。采用流式细胞术检测CD133+CaSki细胞比例，分选前后CaSki细胞中CD133+CaSki细胞占比分别为3.02%±0.63%和95.88%±5.35%，提示分选成功。

1.3 CaSki细胞中miR-23b的检测及其靶基因预测 TRIzol法分别提取CD133+CaSki细胞和宫颈癌非干细胞(CD133-CaSki细胞)总RNA，测定浓度及纯度后，取1 μg RNA逆转为cDNA，产物置于-80 ℃保存。参照real-time PCR试剂盒的反应条件和反应体系进行PCR扩增，引物序列如下：miR-23b正向引物为5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3′， miR-23b反向引物为5′-TTC TTAGCCCGCTCAACACT-3′；内参β-Actin正向引物为5′-GCTATCCTGTACGCCTCTG-3′，内参β-Actin反向引物为5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。miR-23b相对表达量以2-ΔΔCt表示。采用TargetScan和PITA等miRNA靶基因预测分析数据库，预测miR-23b的靶基因。

1.4 miR-23b的转染及CDDP对CD133+CaSki细胞的半数抑制浓度(IC50)检测 将CD133+CaSki细胞按6×103个/孔的密度接种于96孔板，孵育过夜，严格参照Lipofectamine®3000脂质体试剂盒说明书进行操作。将CD133+CaSki细胞分为mimics组、NC组、空白对照组，mimics组转染miR-23b mimics，NC组转染miR-23b NC，空白对照组不做任何处理。转染6 h之后,无血清DMEM培养液稀释CDDP至不同浓度(0、1、2、4、8、16、32 μg/mL)后加入各组，药物处理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，每组设置3个复孔，培养箱中继续培养4 h，450 nm波长下测定OD值，计算CDDP对各组细胞的IC50。

1.5 CD133+CaSki、CD133-CaSki、转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞中ALDH1A1蛋白检测 采用Western blotting法。RIPA裂解液分别提取CD133+CaSki细胞、CD133-CaSki细胞和转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞总蛋白，SDS-PAGE胶分离蛋白后，转移蛋白至PVDF膜，封闭缓冲液室温孵育1 h后，分别加入ALDH1A1和GAPDH一抗，室温孵育1 h，PBST缓冲液洗涤3次后分别加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，PBST缓冲液洗涤3次后ECL发光液显色，进行灰度分析，计算ALDH1A1蛋白相对表达量。ALDH1A1蛋白相对表达量=(ALDH1A1蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值)×100%。

1.6 HEK-293T细胞miR-23b mimics、野生型和突变型pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR的转染、转染质粒编码蛋白的荧光强度检测 将HEK-293T细胞按5×106个/孔的密度接种于6孔板中，孵育过夜。将HEK-293T细胞分为wt 组、mut组、空载体组，每组设置3个复孔，wt 组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR wt(野生型)荧光素酶质粒，mut组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR mut(突变型)荧光素酶质粒，空载体组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO空载体质粒。转染24 h后，采用双荧光素酶试验检测各组细胞转染质粒编码蛋白的荧光强度，计算各组细胞内转染质粒编码蛋白的相对荧光强度。各组细胞内转染质粒编码蛋白的相对荧光强度=(各组目的转染质粒编码蛋白的荧光强度/内参转染质粒编码蛋白的荧光强度)×100%。

2 结果

2.1 CD133+CaSki、CD133-CaSki细胞中miR-23b的表达比较及miR-23b靶基因预测结果 CD133+CaSki、CD133-CaSki细胞中miR-23b的相对表达量分别为0.29±0.05、1.09±0.14，两者相比，P<0.01。miRNA靶点预测公共数据库TargetScan的分析结果显示，ALDH1A1基因可能是miR-23b的靶基因，见图1。

图1 野生与突变ALDH1A1基因3′-UTR与miR-23b序列配对示意图

2.2 CDDP对各组CD133+CaSki细胞的IC50比较 CDDP对mimics组、NC组、空白对照组细胞的IC50分别为(8.18±1.02)、(13.98±1.48)、(14.15±1.27)μg/mL；mimics组与NC组和空白对照组相比，P均<0.05；NC组与空白对照组相比，P>0.05。

2.3 CD133+CaSki、CD133-CaSki、转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞中ALDH1A1蛋白表达比较 CD133+CaSki、CD133-CaSki、转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞中ALDH1A1蛋白相对表达量分别为0.29±0.06、0.12±0.03、0.13±0.04，ALDH1A1蛋白在CD133+CaSki细胞中的相对表达量与CD133-CaSki细胞和转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞相比，P均<0.05；ALDH1A1蛋白在CD133-CaSki细胞中的相对表达量与转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞相比，P>0.05。

2.4 HEK-293T细胞转染质粒编码蛋白的相对荧光强度比较 HEK-293T细胞中，wt组、mut组、空载体组转染质粒编码蛋白的相对荧光强度分别为0.41±0.06、1.12±0.15、1.02±0.15。其中，wt 组转染质粒编码蛋白的相对荧光强度与mut组和空载体组相比，P均<0.05；mut组转染质粒编码蛋白的相对荧光强度与空载体组相比，P>0.05。

3 讨论

肿瘤干细胞对化疗药物具有原发耐药性，在肿瘤化疗耐药中发挥关键性作用。近年来的研究[8]证实，microRNAs表达异常与肿瘤干细胞化疗耐药密切相关，如在恶性胶质瘤干细胞中，miR-125b通过靶向Bcl-2和Bak1基因，调控细胞对化疗药物的敏感性。miR-23b是新近发现的一种具有抑癌基因功能的microRNAs，在肿瘤的多种生理过程中发挥作用，如肿瘤生长、血管形成和侵袭转移等[9]，且与多种实体肿瘤的不良预后密切相关[10]。此外，miR-23b在维持肿瘤干细胞特性和分化中，也占有重要地位[11, 12]。本研究采用流式细胞术成功分选出宫颈癌干细胞CD133+CaSki，发现在CD133+CaSki细胞中miR-23b表达水平降低，且CDDP对CD133+CaSki细胞IC50升高，由此推测miR-23b低表达可能导致了CD133+CaSki细胞对CDDP产生耐药性。紧接着，我们将CD133+CaSki细胞转染miR-23b后，IC50降低，提示miR-23b表达增加能够部分逆转细胞对CDDP的耐药性。

microRNAs能够与靶基因信使RNA 3′-UTR特异性结合，导致翻译抑制或者信使RNA降解。此外，研究[13]发现，microRNAs可影响基因启动子区的CpG岛甲基化作用，在转录水平直接对靶基因进行调控。本研究借助于TargetScan数据库，推测miR-23b的潜在靶基因，并对靶基因功能进行初步筛选，选择其中与肿瘤细胞化疗耐药相关的基因进行验证。

药物代谢酶可通过对化疗药物进行代谢解毒，进而影响细胞的化疗敏感性。目前已经发现多个microRNAs通过调节药物代谢酶基因表达，参与肿瘤干细胞的化疗耐药，如miR-24可与二氢叶酸还原酶(DHFR)信使mRNA 3′-UTR结合，抑制DHFR基因表达，而当DHFR信使RNA 3′-UTR发生自发突变时，miR-24无法与之结合，引起DHFR基因过表达，进而导致肿瘤干细胞对甲氨蝶呤产生耐药性[14]。乙醛脱氢酶(ALDHs)是一类NA(D)P+依赖酶，ALDH1A1是ALDHs超家族成员之一。ALDH1A1能够催化醛类物质氧化为羧基，在正常干细胞及肿瘤干细胞中均高表达，参与细胞的自我保护、增殖和分化等[15]。本研究结果显示，ALDH1A1蛋白在CD133+CaSki细胞中表达增加，而CD133+CaSki细胞对CDDP具有耐药性，提示ALDH1A1可能与CD133+CaSki细胞化疗耐药有关。

有研究[16]证实，ALDH1可促进环磷酰胺、CDDP等化疗药物代谢，降低其细胞毒性，导致肿瘤细胞的化疗耐药。本研究选择常用于表达外源基因且容易转染的HEK-293T细胞，检测miR-23b与ALDH1A1 3′-UTR的结合情况，结果证实miR-23b能够与ALDH1A1 3′-UTR结合，抑制ALDH1A1基因表达，由此，我们推测在CD133+CaSki细胞中，miR-23b低表达引起ALDH1A1基因表达增加，进而导致细胞对CDDP产生耐药，这可能是miR-23b介导CD133+CaSki细胞化疗耐药的内在机制之一。

综上所述，在宫颈癌干细胞中，miR-23b通过抑制ALDH1A1基因表达，增强CDDP化疗敏感性。miR-23b具有作为宫颈癌治疗靶分子的潜能。