宫颈组织癌变过程中肿瘤浸润性中性粒细胞的表达变化及其与CD8+T、部分肿瘤促进因子表达的关系

刘佳，马冬，滑娜，郭颖，樊少蓓，张梦，陈允恩，耿彤瑶，李秀福，王海秋，李鸥

(1 华北理工大学，河北唐山063000；2 河北省出入境检验检疫局；3 唐山市工人医院)

宫颈癌是导致全世界妇女癌症相关死亡的第四大原因[1]。高危型人乳头瘤病毒的持续性感染可诱发宫颈慢性炎症反应[2]。嗜中性粒细胞作为免疫细胞的一种，占体循环白细胞总数的50%～70%，是机体感染或炎症产生的第一道防线[3, 4]，其浸润在肿瘤微环境中则被称为肿瘤浸润性中性粒细胞(tumor-infiltrating neutrophils，TINs)，参与肿瘤的血管生成、免疫调节、生长转移等生物学功能。TINs分为N1型(抑瘤)和N2型(促瘤)两型[5]，可产生或趋化多种组织降解酶类、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞因子和趋化因子参与肿瘤的发生发展[4]。在多种恶性肿瘤患者中如肝癌、胆管癌及宫颈癌等，均有TINs的浸润，且与肿瘤不良预后相关[6～8]；溃疡性结肠炎组织中浸润的TINs可促进其发展成结肠癌[9]。但TINs在宫颈病变组织中的浸润情况目前尚未见报道。本研究观察了TINs在宫颈组织癌变过程中的表达变化，探讨其对免疫细胞CD8+T、部分肿瘤促进因子表达的影响。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年9月～2017年9月在华北理工大学附属唐山市工人医院接受子宫切除手术或宫颈组织活检的患者159例，其中良性子宫疾病患者36例(对照组)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ级(CINⅠ)患者47例(CINⅠ组)、CINⅡ/Ⅲ级患者34例(CINⅡ/Ⅲ组)、宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the cervix，SCC)患者42例(SCC组)。严格按照宫颈组织标本收集的纳入和排除标准收集标本，标本收集后-80 ℃冰箱保存。宫颈组织标本收集纳入标准：①临床资料完整；②病理检查确诊为CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ或SCC；③SCC患者术前未接受化疗、放疗；④对照组标本行宫颈薄层液基细胞学检查未见非典型鳞状细胞或癌细胞。排除标准：①术前3个月内曾行宫颈局部治疗，如阴道用药、冷冻或激光治疗等；②患者当前为妊娠状态；③合并有免疫性疾病或其他恶性肿瘤的患者；④本次手术前合并有急性或慢性感染；⑤合并有血液系统疾病、血栓或出血性疾病。标本的获取均经患者知情同意，并由两位病理医师检查证实诊断。本研究经唐山市工人医院伦理委员会批准。

1.2 各组宫颈组织中的TINs的测算 每组随机取3个组织标本，采用特异性酯酶染色法染色，光学显微镜下观察各组宫颈组织中TINs着色情况，计算TINs细胞百分比。

1.3 各组宫颈组织中CD66b+TINs(CD66b为TINs表面特异性分子标志物[10])及CD8+T细胞的检测 将各组宫颈组织标本分别用兔抗CD66b抗体(1∶100稀释)、兔抗CD8抗体(即用型)进行免疫组织化学检测，由两位病理医师评估CD66b+TINs和CD8+T细胞的免疫染色情况。高倍(HPF，400×)显微镜下观察、拍照，每张宫颈组织切片取5个视野，用Image-pro Plus软件分别计算CD66b+TINs细胞(呈棕黄色)百分比和CD8+T细胞(呈棕黄色)百分比。根据CD66b+TINs细胞百分比平均数，将SCC组分为CD66b+TINs高表达组和CD66b+TINs低表达组。

1.4 SCC组宫颈癌组织中肿瘤促进因子组织降解酶类(MMP-9、MMP-3、MMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞因子(IL-11、IL-8、IL-18)和趋化因子(CCL2、CCL5、CXCL10)mRNA检测 采用RT-qPCR法检测。TRIzol试剂提取宫颈癌组织总RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，内参基因为GAPDH。目的基因及内参基因扩增引物序列如下：MMP-9正向引物为5′-AGTGGGCTACGTGACCTATGA-3′，反向引物为5′-CGGCAACTGCAATCCTT-3′；MMP-3正向引物为5′-CTGGGCCAGGGATTAATGGA-3′，反向引物为5′-AGGGGGAGGTCCATAGAGGG-3′；MMP-1正向引物为5′-GAAAGAAGACAAAGGCAAGTTGA-3′，反向引物为5′-CTCTTGGCAAATCTGGCGTG-3′；VEGF正向引物为5′-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3′，反向引物为5′-ATGCTGCAGGAAGCTCATCT-3′；IL-11正向引物为5′-ACATGAACTGTGTTTGCCGC-3′，反向引物为5′-GAATCCAGGTTGTGGTCCCC-3′；IL-8正向引物为5′-AGAGTGGACCACACTGCGC-3′，反向引物为5′-ATTGCATCTGGCAACCCTACA-3′；IL-18正向引物为5′-AAGATGGCTGCTGAACCAGT-3′，反向引物为5′-GTCCGGGGTGCATTATCTCT-3′；CCL2正向引物为5′- TCCCAAAGAAGCTGTGATCTTCA-3′，反向引物为5′- TCTGGGGAAAGCTAGGGGAA-3′；CCL5正向引物为5′- TCATTGCTACTGCCCTCTGC-3′，反向引物为5′-TCCTTGACCTGTGGACGACT-3′；CXCL10正向引物为5′- CCACGTGTTGAGATCATTGCT-3′，反向引物为5′- TGCATCGATTTTGCTCCCCT-3′；GAPDH正向引物为5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′，反向引物为5′-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相对表达量。每组实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组宫颈组织中TINs百分比比较 TINs在对照组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组、SCC组宫颈组织中的百分比依次升高，分别为14.36%±2.09%、20.57%±3.86%、33.61%±5.94%、56.71%±8.13%，两两相比，P均<0.05。

2.2 各组宫颈组织中CD66b+TINs、CD8+T百分比比较 CD66b+TINs在对照组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组、SCC组中的百分比依次升高，分别为8.07%±1.63%、10.97%±2.98%、15.71%±3.47%、24.83%±4.29%，两两相比，P均<0.05。CD8+T细胞在各组宫颈病变组织中的百分比呈先增高后下降趋势，分别为7.41%±1.35%、10.13%±3.22%、6.36%±2.51%、3.07%±1.09%，两两相比，P均<0.05。CINⅡ/Ⅲ组、SCC组CD66b+TINs与CD8+T百分比均呈负相关(r分别为-0.139、-0.275，P均<0.05)。

2.3 SCC组中CD66b+TINs高表达组和CD66b+TINs低表达组肿瘤促进因子mRNA的表达比较 CD66b+TINs高表达组的MMP-9、MMP-3、MMP-1、VEGF、IL-11、IL-8、IL-18、CCL2、CCL5、CXCL10 mRNA相对表达量均高于CD66b+TINs低表达组，两者相比，P均<0.05，详见表1。

表1 SCC组织中肿瘤促进因子的mRNA相对表达量比较

2.4 SCC组宫颈癌组织中CD66b+TINs表达与SCC患者临床病理参数的关系 SCC组中CD66b+TINs的表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度及临床分期无关(P均>0.05)，详见表2。

表2 SCC组宫颈癌组织中CD66b+ TINs表达与 SCC患者临床病理参数的关系

3 讨论

炎症通过促进或抑制血管的生成和转移在癌症发展中起关键作用[11]。在总循环白细胞中占优势比例的嗜中性粒细胞和淋巴细胞在宿主全身免疫应答中起关键作用，但其对肿瘤进展的作用大部分在肿瘤微环境中实现。TINs参与癌症发生和进展[12～15]。目前，已经发现血液中中性粒细胞与淋巴细胞的比值与许多恶性肿瘤疾病的进展有关[16]。特异性酯酶染色阳性反应仅出现在各阶段的粒细胞中，而且绝大部分的粒细胞是嗜中性粒细胞[3, 4]。故本研究通过特异性酯酶染色法检测不同病理宫颈组织中TINs的浸润情况，以明确中性粒细胞在不同病理宫颈组织中的变化趋势。本研究结果显示，在不同病理宫颈组织中，特异性酯酶染色阳性结果清晰可见，并观察到TINs的浸润数呈逐渐升高趋势，提示TINs参与宫颈癌的发生发展。

CD8+T细胞是抗肿瘤免疫最重要的效应机制之一，是肿瘤组织中浸润的主要淋巴细胞[17]。在动物模型和人类中，CD8+T细胞已被证明在宿主抵抗恶性肿瘤的防御中发挥重要作用[18]。本研究结果显示，宫颈肿瘤组织中CD66b+TINs与CD8+T的表达呈负相关，提示在宫颈肿瘤微环境中TINs浸润与细胞免疫抑制状态有关。

TINs具有两种表型：N1型和N2型。N1型为抑瘤型，可产生次氯酸和活性氧直接杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖[19, 20];N2型为促瘤型，能够分泌组织降解酶、血管内皮生长因子、细胞因子及趋化因子对肿瘤发展起促进作用[4]。国外研究[21, 22]报道，肿瘤微环境中浸润的TINs主要是N2型，N2型TINs可产生大量精氨酸酶，灭活T细胞效应器功能，对CD8+T细胞起免疫抑制作用，从而使肿瘤细胞逃避免疫监视。N2型TINs通过产生组织降解酶类(MMPs)和VEGF改善细胞外基质并增强血管生成的能力，以支持肿瘤细胞增殖、抑制抗肿瘤免疫反应，进而促进肿瘤生长。MMPs是一类与锌结合的具有降解细胞外基质活性的酶家族，MMP-9、MMP-3、MMP-1是其中重要成员，在多种肿瘤的发生发展、浸润和转移中起关键作用[23]。中性粒细胞经活化后可分泌VEGF，诱导肿瘤血管的生成[24]。肿瘤细胞可分泌细胞因子IL-8促进N2型TINs的浸润，反过来N2型TINs促进肿瘤的生长，形成恶性循环[25]。炎性环境中的细胞因子可介导肿瘤细胞的生长，人类中性粒细胞胞质中含有IL-18，IL-18是一种促炎细胞因子，在先天免疫和适应性免疫中都起作用。IL-11是IL-6超家族成员之一，在动物体内实验发现，小鼠腹腔内注射IL-11能上调小鼠胃窦部组织内多种组织降解酶类(MMP-9、MMP-3)的表达[26]，IL-11有可能通过促进MMP-9、MMP-3合成，参与促进宫颈癌的发生发展。趋化因子是一组具有趋化作用的分泌型单链蛋白，参与炎症反应的各个阶段，其主要是通过不同的趋化因子受体将白细胞归巢到炎症组织和部位, 还激活整合素、刺激介质释放、调节血管, 因此趋化因子在炎症过程中发挥中心作用[27]。CCL2主要促进炎症细胞向炎症区域聚集;肿瘤细胞亦可释放CCL5、CXCL10等，招募嗜中性粒细胞的浸润。本研究中，选取与TINs相关的代表性肿瘤促进因子，通过RT-qPCR技术检测宫颈癌组织中肿瘤促进因子的mRNA表达，结果显示在宫颈癌患者TINs高表达组中肿瘤促进因子的表达均高于TINs低表达组，说明在不同宫颈病理组织中，TINs通过产生或趋化多种肿瘤促进因子促进宫颈癌的发生发展。

综上所述，宫颈组织癌变过程中TINs浸润增加；TINs浸润增加抑制了宫颈组织微环境中免疫细胞CD8+T的表达，同时可产生或趋化多种肿瘤促进因子，直接或间接导致宫颈癌的发生发展。后续我们将进一步探讨TINs在分子水平的作用机制，为宫颈癌的早期诊治提供新的靶标。