rno-miR-30b-5p对葡萄膜炎大鼠Notch1和Dll4基因表达的调控作用△

殷学伟 刘滨 魏慧霞 唐凯 毕宏生 郭大东

葡萄膜炎是临床常见的一类致盲性自身免疫性眼病，病因复杂，可造成视力不可逆性损害。Notch 信号通路是调节炎症反应和自身免疫性疾病的重要通路，可通过调控naïve CD4+T细胞的分化影响T辅助细胞的比例平衡发挥作用[1]。有研究发现，在葡萄膜炎眼组织中，浸润性Treg细胞主要表达Notch 1、Notch 2、Jag1和Dll4；Notch信号可负调控实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠浸润性Treg细胞的免疫抑制功能；Notch1缺陷型小鼠Treg细胞的转移显著降低了EAU眼组织中促炎细胞因子的产生和炎症细胞的浸润[2]。Ishida等[3]研究表明，Dll4介导的Notch信号的激活在EAU的发展中起重要作用。

MicroRNA(miRNA)是一类在基因转录后水平调控靶基因表达的功能性小RNA分子，可通过RNA干扰(RNA interference，RNAi)方式调控靶基因的表达。有研究发现，miR-30b可通过负调节Notch信号通路中Notch1基因的表达显著上调树突状细胞(DCs)中IL-10和NO的水平，在免疫应答中发挥负调控子的作用[4]。此外，miR-30b还可下调Notch信号通路中Dll4配体的表达水平，在血管发育和血管生成过程中发挥显著的调控作用[5]。但是，rno-miR-30b-5p对Notch信号通路中Notch1和Dll4基因表达的调控作用在葡萄膜炎发病中的作用机制尚不明确。本研究拟通过动物实验探讨rno-miR-30b-5p调控葡萄膜炎大鼠Notch1和Dll4基因表达的作用机制，阐释miR-30b-5p调控Notch1和Dll4基因表达对葡萄膜炎发展进程的影响，为临床治疗葡萄膜炎提供新的靶点和思路。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器LipofectamineTM2000转染试剂、293T细胞(Invitrogen公司，美国)；荧光显微镜(Olympus IX71，日本)；高纯度质粒抽提试剂盒cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒(Qiagen公司，德国)；CO2培养箱(力康公司，香港)；生物安全柜(Thermo公司，美国)；miR-30b-5p过表达载体菌液、报告基因检测试剂盒、miRNA转染试剂盒(上海吉满生物科技有限公司)；胰蛋白酶、DMEM培养基(Gibco公司，美国)；光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)(1177-1191；氨基酸序列：ADGSSWEGVGVVPDV，上海生工生物工程股份有限公司)；结核菌素(tuberculin，TB)(H37RA；Difco公司，美国)；完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)(Sigma公司，美国)；miRNA组织/细胞快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；LightCycler®480实时荧光定量PCR仪(Roche公司，美国)；Dual-Glo®Luciferase Assay System(Promega公司，美国)；多功能酶标仪(Perkin-Elmer公司，美国)；大鼠Notch1和Dll4蛋白ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)。

1.2实验动物及EAU模型制备选取6～8周龄健康Lewis大鼠(体质量160～180 g；购自北京维通利华公司)12只，随机分为对照组和EAU模型组，每组各6只。EAU模型组大鼠的躯干上皮下、后肢足垫及两侧腹壁各点一次性注射200 μL含有IRBP、TB、CFA和无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)的乳糜液以诱导EAU，对照组大鼠的相同部位注射等体积不含IRBP而含TB、CFA和PBS的乳糜液。

1.3双荧光素酶检测rno-miR-30b-5p调控Notch1和Dll4基因将miR-30b-5p过表达载体菌液接种至5 mL LB培养液中，37 ℃摇床(220 r·min-1)培养过夜，用高纯度质粒抽提试剂盒制备Notch1和Dll4基因质粒。用2.5 g·L-1胰蛋白酶将处于对数生长期的空白293T细胞消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液后进行细胞计数，并接种于24孔培养板过夜培养。转染2 h前更换为新鲜的培养基。取2支1.5 mL EP管，均加入50 μL无血清DMEM培养基，一支EP管加质粒后混匀，另一支EP管加0.633 μL的Lipofectamine®2000转染试剂后混匀，5 min后将两管液体合为一管混匀，室温放置15～20 min后均匀滴加到提前换过液的培养板中，置于CO2培养箱中培养。转染48 h后从培养箱中取出细胞，PBS洗涤2次，每孔加100 μL的1×被动裂解缓冲液(passive lysis buffer，PLB)。将样品转移至EP管中，12 000 r·min-1离心5 min，离心后将上清液移入新的EP管，将20 μL样品加入测量管中，另加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent混匀2～3次后测定相对光单位(relative light unit，RLU)值，并将空白细胞裂解液作为对照孔。将检测后的样品与20 μL配制的Renilla Luciferase Assay工作液混匀 2～3次后测定RLU，同时设置Renilla Luciferase Assay工作液为空白对照孔。通过两次检测的RLU的比值来确定报告基因的激活程度。

1.4Q-PCR检测大鼠脾脏、淋巴结及眼组织中rno-miR-30b-5p、Notch1和Dll4基因的表达免疫后12 d，每组随机各选取4只大鼠，无菌环境下分离脾脏、淋巴结和眼组织，每只大鼠各取部分组织冻存于-80 ℃冰箱中用于ELISA检测，其余样品研磨后尼龙毛柱收集T淋巴细胞，分别提取各部位组织的miRNA和总RNA，K5600分光光度计检测RNA的纯度和浓度(A260/A280为1.8～2.1)。用cDNA反转录试剂盒分别将提取的miRNA和总RNA反转录合成cDNA，Q-PCR检测rno-miR-30b-5p、Notch1和Dll4基因的表达(反应体系为20 μL，每个基因设3个复孔)，其中U6为rno-miR-30b-5p的内参，GAPDH为Notch1和Dll4基因的内参。引物序列分别为：U6反转录引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，双向引物序列包括上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGA-ATTTGCGTGTCAT-3’；rno-miR-30b-5p反转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TGCACTGGATACGACAGCTGA-3’，双向引物序列包括基因特异性引物：5’-GGGCTGTAAACATCCTACAC-3’，反向引物：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；GAPDH上游引物：5’-GACCACAGTCCATGACATCACT-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；Notch1上游引物：5’-ATGGCCCCACCTGCAGACAAGATG-3’，下游引物：5’-GGCACGGCAGGCACAGCGATAG-3’；Dll4上游引物：5’-CAAGAATAGCGGCAGTGGTCGTAA-3’，下游引物：5’-GTA-GCGCAGTCTTGTGAGGGTGTT-3’。Q-PCR反应条件为：94 ℃ 5 s，循环1次；94 ℃ 5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，循环45次。Q-PCR检测结束后，按照2-ΔΔCt计算rno-miR-30b-5p、Notch1和Dll4基因表达情况，并进行数据统计分析。

1.5ELISA检测大鼠脾脏、淋巴结及眼球中Notch1和Dll4蛋白的表达用液氮分别将两组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织研磨至细粉状，加入350 μL RIPA裂解液溶解后电动匀浆30 s，将样品置于冰上，然后超声波细胞粉碎机冰超声20 min，8000 r·min-14 ℃离心20 min。离心后样品去沉淀，将上清转移至新的EP管，采用微量紫外分光光度计测定各组蛋白浓度，ELISA试剂盒检测Notch1和Dll4蛋白的表达情况。

1.6流式细胞仪检测大鼠脾脏和淋巴结中Th17/Treg细胞比例变化分别取两组剩余大鼠的脾脏和淋巴结，研磨后通过200目细胞筛进行细胞初滤，细胞滤液通过尼龙毛柱过滤，然后用大鼠淋巴细胞分离液分离各个组织得到T淋巴细胞(每组计数约106个细胞)。-80 ℃冰箱取出cocktail细胞刺激液，37 ℃水浴解冻。于T淋巴细胞中加入6 μL的cocktail刺激液和4 μL的Golgistop蛋白转运抑制剂，移液器轻轻吹打混匀。用锡箔纸将EP管严密包裹避光，放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育5 h；孵育后首先进行细胞表面染色，然后用破膜溶液对细胞固定破膜后再进行细胞内染色。染色结束后滤网过滤，流式细胞仪检测大鼠脾脏和淋巴结中Th17、Treg细胞水平并分析结果，分析Th17/Treg细胞比例。

2结果

2.1rno-miR-30b-5p调控 Notch1和Dll4基因双荧光素酶检测结果显示，与对照组相比，rno-miR-30b-5p对Notch1和Dll4基因野生型的RLU值有较显著的下调表达，然而对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的RLU值表达水平未见明显改变(图1)。由此可见，rno-miR-30b-5p可明显调控带有Notch1和Dll4基因片段3′UTR基因的表达，Notch1和Dll4为rno-miR-30b-5p调控的靶基因。

图1miRNA与质粒载体转染293T细胞后Notch1和Dll4的表达水平(**P<0.01)

2.2EAU大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中rno-miR-30b-5p基因的表达Q-PCR检测结果显示，与对照组大鼠(1.00)相比，免疫后12 d，rno-miR-30b-5p基因在EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中的表达水平分别为0.41±0.12、0.37±0.09和0.25±0.07，均呈显著下调表达(均为P<0.01)。由此可知，rno-miR-30b-5p的表达水平与葡萄膜炎的发生发展密切相关。

2.3Notch1和Dll4基因和蛋白的表达水平Q-PCR检测结果显示，与对照组大鼠相比，免疫后12 d的EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中的Notch1和Dll4基因水平呈显著上调表达，且差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；ELISA检测结果显示，相比于对照组大鼠，免疫后12 d的EAU模型组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白水平呈明显的上调表达，且差异均具有统计学意义(均为P<0.01)(图2)。由此可知，rno-miR-30b-5p可负调控Notch1和Dll4的表达水平，从而在葡萄膜炎的发病进程中起调控作用。

2.4大鼠脾脏和淋巴结中Th17/Treg细胞比例变化流式细胞仪分别检测两组大鼠脾脏和淋巴结中Th17、Treg细胞因子的表达水平，结果显示，与对照组大鼠相比，免疫后12 d的EAU模型组大鼠中Th17细胞因子的表达水平明显升高(图3)，而Treg细胞因子的表达水平明显降低(图4)。

图2Notch1、Dll4基因和蛋白在两组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织的表达水平(*P<0.05，**P<0.01)。A：Notch1基因表达水平；B：Dll4基因表达水平；C：Notch1蛋白表达水平；D：Dll4蛋白表达水平

图3流式细胞仪检测两组大鼠脾脏和淋巴结中Th17细胞因子的表达水平。A：对照组脾脏；B：EAU模型组脾脏；C：对照组淋巴结；D：EAU模型组淋巴结

图4流式细胞仪检测两组大鼠脾脏和淋巴结中Treg细胞因子的表达水平。A：对照组脾脏；B：EAU模型组脾脏；C：对照组淋巴结；D：EAU模型组淋巴结

3讨论

葡萄膜炎是一类复杂的眼科疾病，多发于青壮年，主要表现为慢性或反复发作的眼部炎症，严重危害人类健康。Notch信号通路对调节炎症反应和自身免疫性疾病具有重要意义，可通过调控naïve CD4+T细胞向Th17、Treg细胞分化，在维持Th17/Treg细胞平衡中发挥重要作用，进而影响机体的生理功能[6]。Yu等[7]研究发现，免疫性血小板减少症患者用DAPT阻断Notch信号通路后，其外周血中Th17/Treg的比例显著降低。注射抗-Dll4抗体亦可显著降低Th17细胞的分化水平[8]，提示Notch信号通路在调节Th17细胞分化、维持Th17/Treg平衡中发挥重要作用。刘滨等[9]证实，Notch信号分子可通过调控Th17和Treg细胞分化、影响Th17/Treg比例平衡，进而影响葡萄膜炎的发生发展。B10.RIII葡萄膜炎小鼠Notch信号通路中Notch1、Notch4、Dll4及NICD等均表达上调。腹腔注射Notch信号通路阻断剂DAPT可明显减轻葡萄膜炎的病情发展[10]。不同时间给予C57BL/6葡萄膜炎小鼠Notch信号通路阻断剂，均可抑制葡萄膜炎的发展[11]。临床研究证实，活动性白塞病患者Notch信号分子高度激活，并伴随Th17高水平应答，阻断 Notch 信号通路可选择性抑制Th17应答[12]。

miRNA是一类在基因转录后水平调控靶基因表达的功能性小RNA分子，可通过RNAi方式调控靶基因的表达。miRNA在多种自身免疫性疾病中表达异常，提示miRNA对自身免疫性疾病的发生发展有重要影响。Cruz等[13]证实，miR-27在小鼠T细胞中的过表达可抑制Treg细胞的分化，导致Treg功能紊乱，进而造成小鼠免疫耐受功能障碍；Mandolesi等[14]研究发现，在IL-1β介导的突触功能障碍中miR-142-3p表达上调起主要作用，可导致多发性硬化症和自身免疫性脑脊髓炎的兴奋毒性损伤；Tang等[15]发现，miR-301a-3p和Th17细胞在类风湿性关节炎的发生发展中发挥重要作用。

miRNA表达异常在葡萄膜炎发病过程中发挥重要作用。动物实验表明，与NF-κB信号通路相关的miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-223-3p和miR-147b在葡萄膜炎大鼠虹膜、睫状体中呈高水平表达，而miR-182-5p、miR-183-5p和miR-9-3p呈低水平表达[16]。研究发现，在急性前葡萄膜炎患者外周血中，miR-143、miR-146a、miR-9-3和miR-205表达水平明显降低，而miR-301a和miR-23a表达水平明显升高[17]；miR-155可通过靶向作用于Ets-1基因调控Th17细胞的免疫应答，抑制miR-155可减少致病性Th17细胞的数量，从而减轻葡萄膜炎患者的病情[18]。我们前期研究结果显示，EAU大鼠外周血淋巴细胞中有36条miRNA表达上调，有31条miRNA表达下调，推测这些miRNA的差异性表达可能与葡萄膜炎的病理机制关系密切[19]；进一步研究表明，rno-miR-30b-5p可调控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因的表达水平，rno-miR-30b-5p在EAU大鼠脾脏和淋巴结中呈下调表达，而Atg5、Atg12和Becn1基因呈明显的上调表达[20]，表明rno-miR-30b-5p可通过影响自噬通路在葡萄膜炎病理机制中发挥作用。

Su等[21]发现，miR-30b可通过负调节Notch信号通路中Notch1基因的表达显著上调树突状细胞中IL-10和NO的水平，从而在免疫应答中发挥负调控子的作用。此外，miR-30b 还可下调Notch信号通路中Dll4配体的表达水平，在血管发育和血管生成过程中起明显的调控作用[22]。有研究发现，在EAU大鼠脾脏和淋巴结中miR-30b-5p表达下降[23]，而Notch1、Notch2和Notch4表达明显升高，Th17/Treg比例失衡[9]，生物信息学预测分析和本实验研究均表明，Notch信号通路上Notch1和Dll4基因均为miR-30b调控的靶基因。EAU大鼠的miR-30b-5p在脾脏、淋巴结和眼组织中的低水平表达与葡萄膜炎的发生发展密切相关。miR-30b-5p可通过调控Notch信号通路上Notch1和Dll4基因的表达水平，影响Th17、Treg细胞的分化，进而影响Th17/Treg的平衡，从而影响葡萄膜炎的发生发展。

总之，深入研究miR-30b-5p调控Notch信号通路相关分子表达的作用机制，对于阐明葡萄膜炎发生发展的病理机制、建立基于以miRNA为作用靶点的新型治疗方法、突破常规免疫性疾病治疗思路具有重要意义。